カイコ前胸腺刺激ホルモンのNMRによる立体構造解析と機能相関

蚕前胸激素的NMR结构分析及功能相关性

基本信息

批准号：
08276218
负责人：
永田宏次
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08276218/
关键词：
前胸腺刺激ホルモン立体構造解析結晶化脱皮変態昆虫

项目摘要

カイコ前胸腺刺激ホルモン(PTTH)の分子量は活性に不要な糖鎖を除いて約25kDaであり、多次元NMR法を用いても立体構造決定が容易でないこと、および、現在までの決定されているシスチンノットファミリーの立体構造はすべてX線結晶解析法により解かれていることから、PTTHの立体構造解析法としてX線結晶解析法の方が妥当であると判断し、PTTHの結晶化の条件検討を散在行列(sparse matrix)法により進めた。結晶化条件検討キットCrystal Screen (Hampton Research)を用いて50種類の塩緩衝液・沈殿剤の組み合わせのもとで初期スクリーニングを行い、いくつかの条件下で微結晶を得ることができた。特に、緩衝液としてNaHepes pH7.5、沈殿剤としてPEG4000あるいはNa citrateを用いた場合に最良の結果が得られた。今後、結晶化条件を精密化することにより、構造解析に用いる質の高い結晶が得られると期待される。また、結晶化に用いる試料タンパク質の安定供給のために、新たに発現系を構築した。6xHis融合カイコPTTHを大腸菌で発現し、封入体を6M尿素で可溶化後、Ni^<2+>固定化樹脂で精製した。この特異的親和性を利用する簡便な精製により大量の組み換えPTTHを安定して調製できるようになった。この方法により得られた組み換えPTTHを用いて、従来よりも効率良く結晶化の条件の精密化を進めることが可能になった。

蚕促甲状腺素激素（PTTH）的分子量约为25 kDa，除去其活性所不需要的糖链，即使使用多维NMR方法也不容易确定其三维结构，并且尚未确定其三维结构。迄今为止，由于胱氨酸结家族的所有三维结构均已通过X射线晶体学解析，因此我们确定X射线晶体学是分析PTTH的三维结构的更合适的方法，并检验了该方法。 PTTH 结晶的条件是稀疏矩阵（sparse Matrix）。该过程使用矩阵方法进行。使用结晶条件评估试剂盒Crystal Screen (Hampton Research)在50种盐缓冲剂和沉淀剂的组合下进行初步筛选，在多种条件下都可以获得微晶。特别是，当使用 NaHepes pH 7.5 作为缓冲剂并使用 PEG4000 或柠檬酸钠作为沉淀剂时，获得了最佳结果。未来，预计通过改进结晶条件，可以获得可用于结构分析的高质量晶体。此外，构建了新的表达系统，保证了用于结晶的样品蛋白的稳定供应。 6xHis融合蚕PTTH在大肠杆菌中表达，包涵体用6M尿素溶解并用Ni 2+ 固定树脂纯化。利用这种特定的亲和力，通过简单的纯化可以稳定地制备大量重组PTTH。使用通过该方法获得的重组PTTH，可以比以前更有效地改进结晶条件。