Mechanistic study of quaternary structure changes of a LysR- type transcriptional regulator

LysR型转录调节因子四级结构变化的机制研究

基本信息

批准号：
22H02563
负责人：
千田俊哉
金额：
$ 10.82万
依托单位：
High Energy Accelerator Research Organization
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

バクテリアに広く分布するLysR型転写制御因子（LTTR）の転写活性化機構は、主として生化学的な手法により解析されてきたが、これまでに得られている生化学的な結果を説明する分子メカニズムは30年以上にわたり不明のままである。これに答える為には、LTTRとプロモータDNA複合体の立体構造に加え、誘導物質によりどのようにLTTRの構造が変化しRNAポリメラーゼと相互作用するかなどに関して、原子レベルの構造的理解が不可欠である。そこで本研究では、我々のグループが長年研究してきたLTTRであるCbnR４量体を取り上げ、結晶構造解析やクライオ電子顕微鏡（電顕）の解析技術を用いて、（１）CbnR４量体の構造多型解析、（２）CbnR４量体と誘導物質（ムコン酸）との複合体構造解析、（３）CbnR４量体、誘導物質（ムコン酸）、プロモータDNAとの３者複合体構造解析、（４）プロモータDNA上のABS配列とCbnRのDNA結合ドメインとの複合体構造解析などを達成することを目指している。初年度は、これら４つのうちで最も困難かつ時間がかかると考えられる、（３）CbnR４量体、誘導物質（ムコン酸）、プロモータDNAとの３者複合体構造解析のための試料調製に集中して研究を進めた。これまでの研究からCbnR４量体－プロモータDNAの結晶構造は低分解能でしか得られていないこと、今後に考えられるRNAポリメラーゼを含んだ複合体の構造解析へのスムーズな移行のため、クライオ電顕による解析を目指した試料調製を行った。その結果、外来DNAの混入の少ないCbnRの精製法を確立し、透析とゲル濾過を組みあわせてCbnR４量体－プロモータDNA複合体の調製などを行うことができた。電子顕微鏡を用いた負染色像の撮影では、CbnR４量体らしき像を確認することができた。

广泛分布于细菌中的LysR型转录调节因子(LTTR)的转录激活机制主要是利用生化方法进行分析，但迄今为止解释所获得的生化结果的分子机制仍不清楚。超过30年。要回答这个问题，必须从原子水平上理解 LTTR 和启动子 DNA 复合物的三维结构，以及 LTTR 的结构如何因诱导剂而发生变化并与 RNA 聚合酶相互作用。因此，本研究以本课题组研究多年的LTTR——CbnR四聚体为研究对象，利用晶体结构分析和冷冻电镜分析技术，（1）鉴定了CbnR四聚体的结构多态性；分析，（2）CbnR四聚体和诱导物（mucon (3) CbnR四聚体、诱导物(粘康酸)和启动子DNA的复合物的结构分析，(4) 启动子DNA上的ABS序列和CbnR的DNA结合域的分析目的是实现结构分析的综合体。第一年，我们将重点进行样品制备（3）CbnR四聚体、诱导物（粘康酸）和启动子DNA三元复合物的结构分析，这被认为是这四个中最困难和最耗时的方法并继续进行研究。从之前的研究中，我们发现CbnR四聚体启动子DNA的晶体结构只能在低分辨率下获得，为了顺利过渡到未来考虑的含有RNA聚合酶的复合物的结构分析，我们将使用冷冻电镜制备样品进行分析。因此，我们建立了一种外源 DNA 污染较少的 CbnR 纯化方法，并能够通过透析和凝胶过滤相结合制备 CbnR 四聚体启动子 DNA 复合物。当使用电子显微镜拍摄负染色图像时，可以确认看起来是CbnR四聚体的图像。