物理化学的解析に適した高分子量型クロマチン因子群の大量発現系の開発

开发适合理化分析的高分子量染色质因子的质量表达系统

基本信息

批准号：
21657030
负责人：
千田俊哉
金额：
$ 1.92万
依托单位：
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

今年度は、大腸菌由来のTacプロモータとコリネ型細菌由来のCspBプロモータを利用して異種タンパク質(ヒストンシャペロンCIAおよびTAF-Iβ)の発現を試みた。CIAおよびTAF-Iβには、精製用にHis-タグを付与した。発現したタンパク質をアフィニティ精製したところ、CIAはTacプロモータで、TAF-IβはCspBプロモータで発現可能であることがわかった。プロモータと発現タンパク質の組み合わせに相性が認められたが、両プロモータはコリネ型細菌を用いた異種タンパク質発現に有効であることがわかった。しかし、コリネ型細菌の菌体破砕効率が低く、発現させたタンパク質の回収効率が低いという問題があった。そこでPhoDタンパク質の分泌シグナル配列を利用し、菌体破砕を必要としない分泌発現を試みた。CIA,TAF-Iβに分泌シグナルを融合しCspBプロモータで発現させたが、発現タンパク質の菌体外への分泌は確認できなかった。問題解決の別法として、菌体破砕を容易にするペニシリンG添加に応答するプロモータをタンパク質発現に利用し、組換えタンパク質発現と菌体破砕効率の向上を同時に実現する系も構築した。この系を用いてTAR-Iβを分泌発現させることを試みたが、まだ明確な結論は得られていない。高分子量型クロマチン因子HIRAに関しても、CspBプロモータおよびペニシリンG応答プロモータ配列を用いて発現を検討中である。今後は、これまでに得られた結果を更に発展させ、コリネ型細菌を異種タンパク質発現に安定的に用いることができるように開発を続けたい。

今年，我们尝试使用源自大肠杆菌的 Tac 启动子和源自棒状细菌的 CspB 启动子来表达异源蛋白（组蛋白伴侣 CIA 和 TAF-Iβ）。 CIA 和 TAF-Iβ 带有 His 标签以进行纯化。表达蛋白的亲和纯化表明，CIA可以使用Tac启动子表达，TAF-Iβ可以使用CspB启动子表达。在启动子和表达的蛋白质的组合中观察到相容性，并且发现两种启动子对于使用棒状细菌表达异源蛋白质是有效的。然而，存在棒状杆菌的破碎效率低、表达蛋白的回收效率低的问题。因此，利用PhoD蛋白的分泌信号序列，我们尝试了不需要细胞破坏的分泌表达。尽管分泌信号与CIA和TAF-Iβ融合并使用CspB启动子表达，但无法证实表达的蛋白质在细菌细胞外的分泌。作为解决该问题的替代方法，我们使用了可响应添加有利于细菌细胞破碎的青霉素G的启动子来表达蛋白质，并构建了一个同时实现重组蛋白表达和提高细菌细胞破碎效率的系统。我们尝试利用该系统分泌和表达TAR-Iβ，但尚未得出明确的结论。我们还在研究使用 CspB 启动子和青霉素 G 响应启动子序列的高分子量染色质因子 HIRA 的表达。未来，我们希望进一步发展目前获得的成果，继续开发棒状细菌，以便我们能够稳定地利用它们来表达异源蛋白。