物理化学的解析に適した高分子量型クロマチン因子群の大量発現系の開発

开发适合理化分析的高分子量染色质因子的质量表达系统

• 批准号: 21657030
• 负责人: 千田 俊哉
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2009
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2009 至 2010
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21657030/
• 关键词: コリネ型細菌; タンパク質発現; ヒストンシャペロン; 分泌発現; 大量発現系; クロマチン因子; 結晶化; X線結晶構造解析; タンパク質精製; コリネ型細菌; タンパク質発現; ヒストンシャペロン; 分泌発現; 大量発現系; クロマチン因子; 結晶化; X線結晶構造解析; タンパク質精製

今年度は、大腸菌由来のTacプロモータとコリネ型細菌由来のCspBプロモータを利用して異種タンパク質(ヒストンシャペロンCIAおよびTAF-Iβ)の発現を試みた。CIAおよびTAF-Iβには、精製用にHis-タグを付与した。発現したタンパク質をアフィニティ精製したところ、CIAはTacプロモータで、TAF-IβはCspBプロモータで発現可能であることがわかった。プロモータと発現タンパク質の組み合わせに相性が認められたが、両プロモータはコリネ型細菌を用いた異種タンパク質発現に有効であることがわかった。しかし、コリネ型細菌の菌体破砕効率が低く、発現させたタンパク質の回収効率が低いという問題があった。そこでPhoDタンパク質の分泌シグナル配列を利用し、菌体破砕を必要としない分泌発現を試みた。CIA,TAF-Iβに分泌シグナルを融合しCspBプロモータで発現させたが、発現タンパク質の菌体外への分泌は確認できなかった。問題解決の別法として、菌体破砕を容易にするペニシリンG添加に応答するプロモータをタンパク質発現に利用し、組換えタンパク質発現と菌体破砕効率の向上を同時に実現する系も構築した。この系を用いてTAR-Iβを分泌発現させることを試みたが、まだ明確な結論は得られていない。高分子量型クロマチン因子HIRAに関しても、CspBプロモータおよびペニシリンG応答プロモータ配列を用いて発現を検討中である。今後は、これまでに得られた結果を更に発展させ、コリネ型細菌を異種タンパク質発現に安定的に用いることができるように開発を続けたい。

今年，我们尝试使用源自coryneform细菌的大肠杆菌和CSPB启动子来表达异源蛋白（组蛋白伴侣CIA和TAF-Iβ）。将CIA和TAF-Iβ给出了标签以进行纯化。表达蛋白的亲和力纯化表明，CIA是TAC启动子，TAF-Iβ可以由CSPB启动子表示。尽管发现启动子和表达蛋白的组合是兼容的，但发现使用Coryneform细菌有效，这两个启动子对异源蛋白表达均有效。但是，存在一个问题，即Coryneform细菌的细胞粉碎效率很低，并且表达蛋白质的恢复效率很低。因此，我们试图使用PHOD蛋白的分泌信号序列表达分泌细胞而无需破坏。分泌信号与CIA和TAF-Iβ融合并使用CSPB启动子表达，但无法确认表达蛋白质的分泌向细胞。作为解决该问题的替代方法，我们还构建了一个系统，该系统同时通过利用启动子来响应添加青霉素G的启动子，从而实现重组蛋白的表达并提高细胞破坏效率，从而促进细胞破坏。我们试图使用该系统表达TAR-Iβ分泌，但尚未得出明确的结论。还使用CSPB启动子和青霉素G响应启动子序列研究了高分子量染色质因子HIRA的表达。将来，我们希望进一步发展到迄今为止获得的结果，并继续开发Coryneform细菌，以便可以稳定地用于异源蛋白表达。