細菌病原性発現を制御する「微細なpH応答機構」の解明

阐明控制细菌致病性表达的“微妙pH响应机制”

基本信息

批准号：
22K15462
负责人：
山中幸
金额：
$ 3万
依托单位：
The Nippon Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15462/
关键词：
酸性 pH HdeD LysR Enterococcus faecalis 細菌病原性プロトン

项目摘要

中性から酸性へのpH変化は、細菌の病原性発現を誘導するシグナルとして古くから普遍的に知られている。細菌は、中性pH 7.0を基準とした時に100から1000倍のプロトン量変化だけではなく、[1] 10倍程度の微細な量的変化に応答する仕組みがあること、そして[2]この機構が細菌病原性発現に関与する仕組みとして普遍的に存在する、という仮説から本研究立案に至った。2022年度は、微細なpH変化に応答する大腸菌膜タンパク質（HdeD）の精製を実施し、ヒト常在グラム陽性細菌Enterococcus faecalisのゲノム解析を行った。まず、X線結晶構造解析によりプロトン応答機構を調べるため、Hisタグで精製可能な大腸菌HdeDを発現するプラスミドを構築した。このプラスミドを用いて、大腸菌細胞内でHis-HdeDの安定的な発現条件を決定した。今後の構造解析に向けて、結晶化のための量と質を保持したタンパク質を精製できると予想される。次に、感知・伝達する機構の普遍性を証明するために、薬剤耐性化が問題となっているE. faecalisをモデル細菌として用いた。大腸菌HdeDは、LysRファミリーに属する転写因子lrhAの発現を制御する。ヒト口腔から単離されたE. faecalis E203株のゲノム配列を決定し、ホモロジー解析を行った。その結果、E. faecalis E203株ゲノムにはlrhAホモログ遺伝子が少なくとも８個存在することがわかった。さらに、これらの８個の候補遺伝子についてルシフェラーゼとのレポーター構築を進めた。今後、レポーター解析を実施することで、E. faecalisにおけるHdeDオーソログの探索が可能になる。

pH值从中性到酸性的变化长期以来被普遍认为是诱导细菌致病性的信号。细菌具有一种机制，不仅能响应比中性 pH 7.0 大 100 至 1000 倍的质子数量变化，而且 [1] 也能响应约 10 倍的微小量变化，[2] 这种机制这项研究背后的想法是基于这样的假设：微生物作为参与细菌致病性表达的机制而普遍存在。 2022 年，我们纯化了对微小 pH 变化做出反应的大肠杆菌膜蛋白 (HdeD)，并分析了粪肠球菌（一种存在于人类体内的革兰氏阳性细菌）的基因组。首先，为了通过X射线晶体学研究质子响应机制，我们构建了表达大肠杆菌HdeD的质粒，该质粒可以用His标签纯化。使用该质粒，确定了 His-HdeD 在大肠杆菌细胞中稳定表达的条件。预计将有可能纯化蛋白质，同时保持未来结构分析结晶所需的数量和质量。接下来，为了证明传感和传递机制的普遍性，我们使用一直存在耐药性问题的粪肠球菌作为模型细菌。大肠杆菌 HdeD 调节属于 LysR 家族的转录因子 lrhA 的表达。对人口腔分离的粪肠球菌E203菌株进行基因组序列测定并进行同源性分析。结果发现，粪肠球菌菌株E203基因组中至少存在8个lrhA同源基因。此外，我们用荧光素酶对这八个候选基因进行了报告基因构建。将来，我们将能够通过进行报告基因分析来寻找粪肠球菌中的HdeD直向同源物。