HIRAーヒストン複合体の立体構造解析に基づいたヌクレオソーム構造変換機構の解明

基于HIRA-组蛋白复合物三维结构分析阐明核小体结构转换机制

基本信息

批准号：
20051031
负责人：
千田俊哉
金额：
$ 3.84万
依托单位：
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

真核細胞生物のゲノムDNAは、数種類のピストンとの複合体であるヌクレオソーム構造を形成して核内にコンパクトに収納されている。このヌクレオソーム構造は、物理的、化学的損傷からDNAを保護する一方で、転写などのDNA上で起こる反応を抑制している。従って、生体内には遺伝子発現の要不要に応じて、特定の領域のヌクレオソーム構造を破壊したり再形成させたりする分子機構が存在する。しかし、その分子機構の詳細は未だ不明である。本研究では、ヒストンシャペロンHIRAがCIAと協調的に機能してヌクレオソームの再形成に関与するという知見に基づいてmRA一ヒストンーCIA複合体の立体構造を明らかにし、クロマチン構造変換の分子機構の解明を目指す。昨年度の研究から田RAを大腸菌で発現することができることがわかったので、本格的にHIRAの大量発現、精製系の確立に取り掛かった。その結果、ニッケルカラムとイオン交換カラムを用いることで、かなり高純度のmRAを2Lの大腸菌培養液からmgのレベルで精製することに成功した。次に、HIRAとピストンH3.3/H3.1などとの複合体の構造解析を行う上で必要なヒト由来ピストンH3.31H3.1などの大量発現系の確立を行った。発現は大腸菌で行った。この際、大腸菌における低頻度コドンを高頻度コドンに置換し効率のよい発現を目指した。H3.1-H4およびH3.3-H4の共発現系をそれぞれ作成しタグ精製を行ったところ、両者ともに複合体を精製することができた。以上述べた通り、田RAに加えピストンH3.1-H4,H3.3-H4複合体の精製に成功したので、今後はこれらの複合体をさらに組み合わせて結晶化をはじめとする物理化学解析を行っていく予定である。

真核生物的基因组DNA通过形成核小体结构紧凑地储存在细胞核中，核小体结构是由多种类型的活塞组成的复合体。这种核小体结构可以保护 DNA 免受物理和化学损伤，同时抑制 DNA 上发生的反应，例如转录。因此，在体内，存在一种分子机制，根据基因表达是否必要来破坏或重新形成特定区域的核小体结构。然而，其分子机制的细节仍不清楚。本研究基于组蛋白伴侣HIRA与CIA协同作用并参与核小体重组的知识，阐明了mRA-组蛋白-CIA复合物的三维结构，并阐明了染色质结构转变的分子机制。。去年的研究表明，HIRA可以在大肠杆菌中表达，因此我们开始认真建立HIRA的大规模表达和纯化系统。结果，通过使用镍柱和离子交换柱，他们成功地从2L大肠杆菌培养液中将纯度极高的mRA纯化至毫克级。接下来，我们建立了人源活塞H3.31H3.1的大规模表达系统，这对于HIRA和活塞H3.3/H3.1之间的复合物的结构分析是必需的。在大肠杆菌中进行表达。此时，我们的目标是通过用高频密码子替换大肠杆菌中的低频密码子来高效表达。当我们创建 H3.1-H4 和 H3.3-H4 的共表达系统并进行标签纯化时，我们能够纯化两者的复合物。如上所述，除了TaRA之外，我们还成功纯化了活塞H3.1-H4和H3.3-H4复合物，因此将来我们将进一步组合这些复合物并进行结晶等物理化学分析。去那里。