ヒストンH3バリアントとその相互作用因子によるクロマチン形成機構の解析

组蛋白H3变体染色质形成机制及其相互作用因素分析

基本信息

批准号：
09J04280
负责人：
越阪部晃永
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Waseda University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2011
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、ヒストンH3のバリアントやそれらと相互作用する因子群を、生化学的および構造生物学的手法を用いて解析し、H3バリアントおよびそれらの相互作用因子群によるクロマチン構造形成のメカニズムを明らかにすることである。これまでに、ヒト由来のH3について、8つのバリアントが報告されているが、それらのクロマチン形成に関する詳細な役割は未だ明らかにされていない。そこで、H3バリアントの生体内における特異的な機能発現は、それぞれの相互作用因子群によってなされていると考え、H3バリアントと相互作用する因子群を、リコンビナントヒストンを用いたプロテオーム解析法により探索した。その結果、新規ピストン相互作用因子としてヒトSPT2を同定した。ヒトSPT2は出芽酵母の転写因子SPT2と共通するSpt2ドメインを有するタンパク質であるが、機能未知のタンパク質であった。そこで、SPT2の機能解析を行うために、リコンビナントタンパク質として精製したヒトSPT2を用いた生化学的解析を行った。その結果、精製したヒトSPT2はコアヒストンと直接相互作用し、ヌクレオソームの形成を促進した。また、ヒトSPT2はDNAとも直接結合し、特に分岐したDNA基質に優先的に結合した。さらに、HeLa細胞を用いた免疫染色実験を行い、SPT2の局在解析を行った。その結果、SPT2は核小体領域に局在し、特にrRNAの転写を行うRNAポリメラーゼIと共局在した。次に、SPT2の生体内での機能を解析するために、SPT2欠損ニワトリDT40細胞を樹立し、細胞生物学的解析を行った。その結果、SPT2欠損細胞がRNAポリメラーゼIの阻害剤に対して著しく感受性を示した。以上の結果から、新規ヒストン相互作用因子として同定したSPT2が、これまで不明な点が多かった核小体領域のクロマチンのダイナミクスに関与することが考えられた。

这项研究的目的是分析使用生化和结构生物学技术与它们相互作用的组蛋白H3变体，以阐明H3变体及其相互作用因素的染色质结构形成的机制。到目前为止，已经报道了八种人类衍生的H3变体，但尚未阐明它们在染色质形成方面的详细作用。因此，认为相互作用因子组实现了H3变体在体内的特定功能表达，并且使用重组组蛋白通过蛋白质组分析来搜索与H3变体相互作用的因子组。结果，人类SPT2被鉴定为新型活塞相互作用因子。人SPT2是一种具有SPT2结构域的蛋白质，它是发芽酵母的转录因子SPT2共有的，但是一种功能未知的蛋白质。因此，为了对SPT2进行功能分析，使用纯化的人SPT2作为重组蛋白进行生化分析。结果，纯化的人类SPT2与核心组蛋白直接相互作用并促进了核小体的形成。人SPT2还直接与DNA结合，特别是优先与分支DNA底物结合。此外，使用HeLa细胞进行免疫染色实验，以分析SPT2的定位。结果，SPT2位于核仁区域，特别是与RNA聚合酶I一起共定位，该聚合酶在转录上进行RRNA。接下来，为分析SPT2的体内功能，建立了SPT2缺陷鸡DT40细胞，并进行了细胞生物学分析。结果，SPT2缺陷型细胞对RNA聚合酶I的抑制剂显着敏感。从上述结果中，人们认为被鉴定为新型组蛋白相互作用因子的SPT2参与了核仁区域的染色质动力学，以前尚不清楚。