緑膿菌エコーシステムにおけるバイオフィルムの酵素・遺伝学的特性解析とその応用

铜绿假单胞菌回声系统中生物膜的酶学和遗传表征及其应用

基本信息

批准号：
13760067
负责人：
橋本渉
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

バイオフィルム(BF)は、微生物の重要な生存様式(エコーシステム)であるが、その系の複雑さのために充分な解析が進んでいない。運動性を有する緑膿菌は、菌体外に多糖アルギン酸を分泌し、これをBFとして周囲から隔離された生存様式を示し、時には重篤な呼吸器疾患を発症する。さらに、BFを分解し遊離することにより、新たな部位へ移動する。BF形成に関わる緑膿菌の運動性には、ポリリン酸キナーゼ(PPK)により合成されるポリリン酸の関与が指摘されている。緑膿菌はペリプラズムにアルギン酸分解酵素(AlgL)を有するが、その遺伝子はアルギン酸合成遺伝子群と同一オペロンに存在している。AlgLの遺伝子と活性発現との相関が不明なため、AlgLの生理的意義とBF分解制御は殆ど未知である。そこで本研究では、緑膿菌BFに焦点を当て、特にPPKとAlgLが各々関わるBF形成及び分解制御機構を明らかにすることを目的とする。AlgL大量発現大腸菌(全タンパク質の約30%)を育種し、精製系を確立した。AlgLは、これまでに当研究室で構造機能相関を明らかにしているSphingomonas属細菌由来の酵素A1-IIIと有意な相同性(30%)を示した。A1-IIIの触媒残基に相当するAlgLのHis202及びTyr256を各々Ala及びPheに置換した変異体は、酵素活性を示さなかった。従って、His202及びTyr256は、AlgLの活性発現に必須であることが明らかになった。今回、同定した触媒残基の知見に基づいて、緑膿菌ゲノム上のAlgL遺伝子に変異を導入することにより、アルギン酸合成系を修飾することなく、AlgLの機能のみを欠失させた変異株の作製が可能となる。今後、本変異株を用いて、BF分解制御機構を解析する。また、運動性を制御するPPKの構造機能相関を明らかにするため、蒸気拡散法を用いたPPKの結晶化を行っている。

生物膜（BFS）是微生物生存（回声系统）的重要形式，但是由于系统的复杂性，尚未进行足够的分析。铜绿假单胞菌在细菌外分泌多糖藻酸，该藻类用它作为BF创建与周围区域分离的生存模式，有时会出现严重的呼吸道疾病。此外，BF被分解和释放，它移至新站点。指出，铜绿假单胞菌的运动能力与BF形成有关，已指出，由多磷酸激酶（PPK）合成的多磷酸盐的参与。铜绿假单胞菌具有藻酸盐降解酶（ALGL），但该基因与藻酸盐合成基因组相同的操纵子中存在。 ALGL及其BF降解控制的生理意义几乎是未知的，因为ALGL的基因和活性表达之间的相关性尚不清楚。因此，这项研究的重点是铜绿假单胞菌BF，旨在阐明PPK和ALGL尤其涉及BF形成和降解控制的机制。大肠杆菌（约占总蛋白质的30％）被繁殖以建立纯化系统。 ALGL与来自鞘氨拟补组织的酶A1-III显示出显着的同源性（30％），这些酶以前揭示了我们实验室中的结构和功能相关性。与A1-III的催化残基相对应的His202和Tyr256的突变体分别被ALA和PHE取代，没有酶活性。因此，已经揭示了His202和Tyr256对于ALGL的活性表达至关重要。基于通过在铜绿假单胞菌基因组上引入突变的催化残基的发现，可以创建一个突变株，该突变菌株仅删除了而无需修改藻酸盐合成系统而仅删除了ALGL的功能。将来，将使用该突变菌株分析BF降解调节的机理。此外，为了阐明控制运动能力的PPK的结构和功能相关性，使用蒸气扩散将PPK结晶。