X線結晶構造解析による多糖リアーゼの構造・機能相関と構造的一般則

基于X射线晶体结构分析的多糖裂解酶的构效关系及一般结构规则

基本信息

批准号：
11760062
负责人：
橋本渉
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

多糖リアーゼは、多糖分子中のウロン酸を認識し、β脱離反応を触媒する。本研究は、多糖(アルギン酸,ゲラン,キサンタン)に異なる様式で作用するリアーゼの構造を解明し、多糖リアーゼ反応における構造的一般則を確立することを目的とする。各リアーゼについて以下の知見を得た。【アルギン酸リアーゼ】スフィンゴモナス属細菌は、エンド型アルギン酸リアーゼ(3種類:A1-I,A1-II,A1-III)とエキソ型オリゴアルギン酸リアーゼ(OAL)を持つ。αバレル構造を基本骨格に持つA1-IIIについて、部位特異的変異及び酵素-アルギン酸3糖の複合体のX線結晶構造解析を行い、その反応機構を解析した。A1-IIIのチロシン-246とヒスチジン-192がリアーゼ反応に必須であり、チロシン-246がアルギン酸のC5位のプロトンの引抜きと切断部位へのプロトンの供与を担っていることを明らかにした。硫安とポリエチレングリコールで調製したA1-IとA1-IIの結晶は、各々単斜晶系P2_1及び立方晶系P4_32_12の空間群に属した。現在、各結晶の構造解析が進行中である。オリゴアルギン酸にエキソ型で作用するOALは、硫安で結晶化した。【グランリアーゼ】枯草菌が生産するゲランリアーゼは、多糖ゲランを非還元末端より4糖単位で切断する(エキソ型)。本酵素は、263kDaの巨大な前駆体から翻訳後プロセッシングにより130kDaの成熟体に変換される。成熟体の大量発現・精製系を構築し、現在、結晶化条件を探索している。【キサンタンリアーゼ】多糖キサンタンの分岐鎖に作用する枯草菌キサンタンリアーゼ(分岐鎖型)の1次構造及び立体構造モデリング解析により、本酵素は、α/βバレル構造を持つヒアルロン酸リアーゼと類似しており、活性に必要なアスパラギン-194、ヒスチジン-246、チロシン-255がαバレル構造ドメインに存在した。以上の研究により、多糖リアーゼは、αバレル構造を基本骨格に持つスーパーファミリーを形成することが示唆された。

多糖裂解酶识别多糖分子中的糖醛酸并催化β-消除反应。本研究的目的是阐明以不同方式作用于多糖（海藻酸、结冷胶和黄原胶）的裂解酶的结构，并建立多糖裂解酶反应的一般结构规则。关于每种裂合酶获得以下结果。 [藻酸裂解酶] 鞘氨醇单胞菌有内型藻酸裂解酶（A1-I、A1-II、A1-III 3种）和外型寡聚藻酸裂解酶（OAL）。针对以α-桶结构为基本骨架的A1-III，我们对酶-海藻酸三糖复合物进行了定点突变和X射线晶体结构分析，并分析了反应机理。结果表明，A1-III的酪氨酸246和组氨酸192对于裂解酶反应至关重要，酪氨酸246负责提取海藻酸C5位的质子并将质子提供给裂解位点。用硫酸铵和聚乙二醇制备的A1-I和A1-II晶体分别属于单斜晶系P2_1和立方晶系P4_32_12空间群。目前正在对每种晶体进行结构分析。 OAL 以外切形式作用于低聚藻酸盐，在硫酸铵中结晶。 [Granlyase] 枯草芽孢杆菌产生的结冷胶裂解酶将多糖结冷胶从非还原端裂解成四糖单元（外切型）。该酶通过翻译后加工从 263kDa 的大前体转化为 130kDa 的成熟形式。我们已经构建了成熟形式的大规模表达和纯化系统，目前正在寻找结晶条件。 [黄原胶裂解酶] 作用于多糖黄原胶的支链的枯草芽孢杆菌黄原胶裂解酶（支链型）的一级结构和三维结构模型分析表明，该酶与透明质酸裂解酶相似，具有α/ β桶结构域。活性所需的天冬酰胺-194、组氨酸-246和酪氨酸-255存在于α-桶结构域中。上述研究表明多糖裂解酶形成了一个以α-桶结构为基本骨架的超家族。