多糖の合成と分解に関わるスヒンゴモナス属細菌表層の穴構造と新規高分子取り込み機構

参与多糖合成和分解的Shingomonas细菌表层的孔结构和新型聚合物摄取机制

基本信息

批准号：
08760083
负责人：
橋本渉
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.特異な細胞表槽構造を有するスヒンゴモナス属細菌における高分子膜透過機構について以下の知見を得た。アルギン酸分解菌として単離されたSphingomonas A1(A1株)において、アルギン酸を高分子のまま細胞内に取り込む機構(ピット構造)の存在を示唆している。A1株を変異剤で処理し、アルギン酸資化能の弱い菌を作製した。変異株は高分子アルギン酸では生育が悪く、アルギン酸を酵素的に分解したオリゴ糖は資化することができた。一方、変異株のアルギン酸分解酵素(アルギン酸リアーゼ)は、活性を保持していた。このことより、変異株ではアルギン酸の細胞内取り込み能が正常でないことが示唆された。高分子アルギン酸で培養した野生株及び変異株の細胞表層を電子顕微鏡で観察すると、野生株ではアルギン酸特異的なピット構造が存在したが、変異株では存在しなかった。以上の結果、A1株の高分子アルギン酸取り込みにはピット構造が関与していることを確認した。2.Sphingomonas paucimobilisが生合成するスヒンガン(ゲラン)の分解について以下の知見を得た。ゲランは4糖の反復配列を有する直鎖状の多糖である。ゲランで固めたゲランプレートに陥没した状態で生育する微生物を水田土壌より単離・同定した結果、Bacillus属細菌(GL1株)であった。DL1株をゲランを炭素源として培養し、その培養濾液からゲラン分解酵素(ゲランリアーゼ)を精製した。精製した酵素は分子量14万の単純タンパク質であり、細菌多糖の中でもゲランのみを特異的に分解した。分解物を精製し、構造決定を行ったところ、非還元末端糖に2重結合を持つグルクロン酸、還元末端糖にグルコースを有する4糖であった。これより、ゲランリアーゼはグルコースとグルクロン酸の間をリアーゼ的に切断することが判明した。GL1株のゲノムDNAを抽出し、大腸菌でゲノムライブラリーを作製し、ライブラリーよりゲランリアーゼをコードする遺伝子を単離した。

1.关于神经鞘氨醇单胞菌属细菌的聚合物膜渗透机制，获得了以下发现，该细菌具有独特的细胞表面槽结构。这表明，作为藻酸盐降解菌分离出来的鞘氨醇单胞菌A1（A1株）具有将藻酸作为聚合物摄入细胞的机制（凹坑结构）。我们用诱变剂处理菌株 A1，以产生同化海藻酸盐能力较弱的菌株。该突变株在高分子量海藻酸上生长不良，但能够同化通过酶分解海藻酸获得的寡糖。另一方面，突变菌株的藻酸盐降解酶（藻酸盐裂解酶）保留了其活性。这表明突变菌株将海藻酸摄入细胞的能力不正常。用电子显微镜观察高分子量海藻酸培养的野生型菌株和突变型菌株的细胞表面层，野生型菌株中存在海藻酸特有的凹坑结构，而突变型菌株中则没有。。上述结果证实，凹坑结构参与了菌株A1对高分子量海藻酸盐的摄取。 2.关于由少动鞘氨醇单胞菌生物合成的suhingan（gerlan）的降解，获得了以下发现。娇兰是一种具有重复四糖序列的线性多糖。从水稻土中分离并鉴定了在用结冷胶硬化的结冷平板上以抑制状态生长的微生物，结果发现该微生物是芽孢杆菌属细菌(GL1株)。使用结冷胶作为碳源培养DL1菌株，并从培养滤液中纯化结冷胶降解酶(结冷胶裂解酶)。纯化的酶是一种分子量为14万的简单蛋白质，它只特异性降解细菌多糖中的结冷胶。当纯化分解产物并确定其结构时，发现它是一种四糖，其非还原端糖具有双键的葡萄糖醛酸，还原端糖具有葡萄糖。这表明结冷胶裂解酶以裂解酶方式裂解葡萄糖和葡萄糖醛酸。提取GL1菌株的基因组DNA，使用大肠杆菌创建基因组文库，并从文库中分离编码结冷胶裂解酶的基因。