高分子物質の結合と分解に関わるタンパク質・酵素の機能を規定する動的高次構造の解析

分析动态高阶结构,定义参与聚合物结合和分解的蛋白质和酶的功能

基本信息

  • 批准号:
    15780053
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 2.37万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
  • 财政年份:
    2003
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2003 至 2005
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

高分子物質(キサンタン)の分解に関わるBacillus属細菌(GL1株)由来キサンタンリアーゼ(XLY)の構造機能解析を行い、以下のことを明らかにしてきた。XLYは、一次構造に基づいて多糖リアーゼファミリーPL-8に分類される。XLYのX線結晶構造(α5/α5バレル+逆並行βシート)を決定し、XLYが同じPL-8酵素の連鎖球菌ヒアルロン酸リアーゼ(HLY)やコンドロイチンリアーゼ(CLY)と同様の基本骨格を示すことを明らかにした。また、XLY、CLY、及びHLYの活性部位付近の微細な構造が極めて類似していることも見出し、XLYの触媒反応に関わる分子機構を解析することにより、PL-8酵素に共通の触媒反応機構を提示できると考えられた。XLY,HLY,CLYに共通する高次構造に基づき、触媒に直接関与すると考えられたXLYのN194、H246、Y255の部位特異的変異体を作製し、各変異体の酵素学的性質を調べた。N194A、H246A、Y255Fはいずれも野生型に比して活性が1/500以下に低下したことから、これらの3残基がXLYの活性発現に重要であることが示された。このことはPL-8酵素には共通の触媒反応機構があることを支持する結果である。活性低下型変異体であるN194Aのリガンド非結合型、生成物(ピルビン酸マンノース)結合型、及び基質[キサンタン構成最小ユニット(5糖)]結合型の結晶構造を、それぞれ、2.3、1.8、及び2.1Å分解能で決定した。得られた高次構造に基づき、Y255が酸触媒・塩基触媒として機能する触媒反応機構を提唱した。XLYの触媒反応機構は、これまでHLYの構造に基づいて提唱されていたものとは異なり、むしろCLYにおいて提唱されたものと類似していた。PL-8酵素における共通の高次構造や触媒残基の知見から、XLY及びCLYに見られる触媒反応機構がPL-8酵素に共通するものであることが強く示唆された。また、リガンド結合によりα5/α5バレルドメインの動的構造変化が認められたことから、今後触媒反応におけるドメインの動的機構を明らかにする。
我们对来自芽孢杆菌(GL1菌株)的黄原胶裂解酶(XLY)进行了结构和功能分析,该酶参与了聚合物(黄原胶)的分解,并阐明了以下内容。 XLY 根据其一级结构被归类为多糖裂解酶家族 PL-8。测定了XLY的X射线晶体结构(α5/α5桶+反平行β片),表明XLY具有与所揭示的相同PL-8酶链球菌透明质酸裂解酶(HLY)和软骨素裂解酶(CLY)相同的基本骨架。那。我们还发现XLY、CLY和HLY活性位点附近的精细结构极其相似,并且通过分析XLY参与催化反应的分子机制,我们发现PL-8酶共有的催化反应机制。被认为有可能呈现基于XLY、HLY和CLY的共同高阶结构,我们创建了XLY的N194、H246和Y255位点特异性突变体,这些突变体被认为直接参与催化,并研究了每个突变体的酶学性质.与野生型相比,N194A、H246A和Y255F的活性均降低至1/500或更低,表明这三个残基对于XLY活性的表达很重要。这一结果支持PL-8酶具有共同的催化反应机制。 N194A(一种活性降低的突变体)的晶体结构分别为 2.3、1.8 和 2.3、1.8、2.3、1.8 和 1.8,其中未配体、产物(丙酮酸甘露糖)结合和底物 [黄原胶最小单位(五糖)]结合形式以 2.1 Å 分辨率测定。基于所获得的高阶结构,我们提出了Y255充当酸催化剂和碱催化剂的催化反应机理。 XLY的催化反应机理与之前基于HLY结构提出的催化反应机理不同,而与CLY提出的催化反应机理非常相似。对 PL-8 酶中常见高阶结构和催化残基的了解强烈表明,在 XLY 和 CLY 中观察到的催化反应机制对于 PL-8 酶是常见的。此外,由于我们观察到配体结合时α5/α5桶结构域的动态结构变化,我们将阐明该结构域在催化反应过程中的动态机制。

项目成果

期刊论文数量(7)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Wataru Hashimoto: "Crystal structure of Bacillus sp. GL1 xanthan lyase, which acts on the side chains of xanthan"Journal of Biological Chemistry. 278(9). 7663-7673 (2003)
Wataru Hashimoto:“作用于黄原胶侧链的芽孢杆菌属 GL1 黄原胶裂解酶的晶体结构”生物化学杂志。
  • DOI:
  • 发表时间:
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  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
Crystal structure of unsaturated glucuronyl hydrolase, responsible for the degradation of glycosaminoglycan, from Bacillus sp.GL1 at 1.8Å resolution
芽孢杆菌属 GL1 中负责降解糖胺聚糖的不饱和葡萄糖醛酸水解酶的晶体结构,分辨率为 1.8Å
Masayuki Yamasaki: "Crystallization and preliminary X-ray analysis of alginate lyase, a member of polysaccharide lyase family PL-7, from Pseudomonas aeruginosa"Acta Crystallographica setion D. 59. 1499-1501 (2003)
Masayuki Yamasaki:“来自铜绿假单胞菌的藻酸盐裂解酶(多糖裂解酶家族 PL-7 的成员)的结晶和初步 X 射线分析”Acta Crystallographa 第 D. 59. 1499-1501 (2003)
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  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
Yumiko Mishima: "Crystal structure of AlgQ2, a macromolecule (alginate)-binding protein of sphingomonas sp. A1, complexed with an alginate tetrasaccharide at 1.6-Å resolution"Journal of Biological Chemistry. 278(8). 6552-6559 (2003)
Yumiko Mishima:“AlgQ2 的晶体结构,一种鞘氨醇单胞菌 A1 的大分子(藻酸盐)结合蛋白,以 1.6-Å 分辨率与藻酸盐四糖复合”《生物化学杂志》278(8)(2003)。
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  • 发表时间:
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  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
Proteomics-based identification of outer-membrane proteins responsible for import of macromolecules in Sphingomonas sp.A1 : alginate-binding flagellin on the cell surface
基于蛋白质组学的鞘氨醇单胞菌 A1 负责输入大分子的外膜蛋白的鉴定:细胞表面的藻酸盐结合鞭毛蛋白
  • DOI:
  • 发表时间:
    2005
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    Wataru Hashimoto
  • 通讯作者:
    Wataru Hashimoto
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