高分子物質の結合と分解に関わるタンパク質・酵素の機能を規定する動的高次構造の解析

分析动态高阶结构，定义参与聚合物结合和分解的蛋白质和酶的功能

• 批准号: 15780053
• 负责人: 橋本 渉
• 金额: $ 2.37万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15780053/
• 关键词: Bacillus; キサンタンリアーゼ; X線結晶構造解析; 多糖リアーゼファミリー; ヒアルロン酸リアーゼ; コンドロイチンリアーゼ; 反応機構; 動的構造; スフィンゴモナス属細菌; 高分子物質; アルギン酸結合タンパク質; アルギン酸リアーゼ; 動的高次構造; ドメイン開閉; ループ開閉

高分子物質(キサンタン)の分解に関わるBacillus属細菌(GL1株)由来キサンタンリアーゼ(XLY)の構造機能解析を行い、以下のことを明らかにしてきた。XLYは、一次構造に基づいて多糖リアーゼファミリーPL-8に分類される。XLYのX線結晶構造(α5/α5バレル+逆並行βシート)を決定し、XLYが同じPL-8酵素の連鎖球菌ヒアルロン酸リアーゼ(HLY)やコンドロイチンリアーゼ(CLY)と同様の基本骨格を示すことを明らかにした。また、XLY、CLY、及びHLYの活性部位付近の微細な構造が極めて類似していることも見出し、XLYの触媒反応に関わる分子機構を解析することにより、PL-8酵素に共通の触媒反応機構を提示できると考えられた。XLY,HLY,CLYに共通する高次構造に基づき、触媒に直接関与すると考えられたXLYのN194、H246、Y255の部位特異的変異体を作製し、各変異体の酵素学的性質を調べた。N194A、H246A、Y255Fはいずれも野生型に比して活性が1/500以下に低下したことから、これらの3残基がXLYの活性発現に重要であることが示された。このことはPL-8酵素には共通の触媒反応機構があることを支持する結果である。活性低下型変異体であるN194Aのリガンド非結合型、生成物(ピルビン酸マンノース)結合型、及び基質[キサンタン構成最小ユニット(5糖)]結合型の結晶構造を、それぞれ、2.3、1.8、及び2.1Å分解能で決定した。得られた高次構造に基づき、Y255が酸触媒・塩基触媒として機能する触媒反応機構を提唱した。XLYの触媒反応機構は、これまでHLYの構造に基づいて提唱されていたものとは異なり、むしろCLYにおいて提唱されたものと類似していた。PL-8酵素における共通の高次構造や触媒残基の知見から、XLY及びCLYに見られる触媒反応機構がPL-8酵素に共通するものであることが強く示唆された。また、リガンド結合によりα5/α5バレルドメインの動的構造変化が認められたことから、今後触媒反応におけるドメインの動的機構を明らかにする。

源自涉及聚合物物质降解（Xanthan）的芽孢杆菌细菌（GL1菌株）的黄原裂解酶（XLY）（XLY）的结构和功能分析，揭示了以下情况：Xly基于其主要结构将XLY分类为多糖裂解酶族族PL-8。确定了Xly的X射线晶体结构（α5/α5桶 +反平行的β片），并揭示了Xly表现出与同一PL-8酶，链球菌透明质酸裂解液酶（HLY）（HLY）（HLY）（HLY）和软骨蛋白酶（Cly）的类似碱性骨架。还发现，Xly，Cly和Hly的活性位点附近的细胞结构非常相似，并且通过分析Xly催化反应所涉及的分子机制，人们认为可以提出PL-8酶的常见催化反应机制。基于Xly，Hly和Cly共有的高阶构象，Xly的N194，H246和Y255的位置定向突变体被认为是直接参与催化剂的，并检查了每个突变体的酶特性。与野生型相比，N194A，H246A和Y255F的活性都降低到小于1/500，这表明这三个残基对于XLY活性表达很重要。这导致支持PL-8酶的常见催化机制。分别在2.3、1.8和2.1Å的分辨率下确定了配体无抗能，产物（甘露酮）结合和底物[Xanthan组成最小单位（五糖）]的晶体结构。基于获得的高阶结构，提出了一种催化反应机制，其中Y255用作酸催化剂和碱催化剂。 Xly的催化反应机理与基于HLY的结构提出的催化反应机理不同，但与CLY中提出的相似。 PL-8酶中常见的高阶结构和催化残基的发现强烈表明，在Xly和Cly中看到的催化反应机制对于PL-8酶是常见的。此外，由于配体的结合，已经观察到α5/α5桶结构域的动态结构变化，将来将阐明该结构域在催化反应中的动态机制。

项目成果

Molecular identification and characterization of an alginate-binding protein on the cell surface of Sphingomonas sp A1

• DOI: 10.1016/j.bbrc.2004.07.184
• 发表时间: 2004-09-24
• 期刊: BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS
• 影响因子: 3.1
• 作者: He, JS;Nankai, H;Murata, K
• 通讯作者: Murata, K

Wataru Hashimoto: "Crystal structure of Bacillus sp. GL1 xanthan lyase, which acts on the side chains of xanthan"Journal of Biological Chemistry. 278(9). 7663-7673 (2003)

Wataru Hashimoto：“作用于黄原胶侧链的芽孢杆菌属 GL1 黄原胶裂解酶的晶体结构”生物化学杂志。

Crystal structure of unsaturated glucuronyl hydrolase, responsible for the degradation of glycosaminoglycan, from Bacillus sp.GL1 at 1.8Å resolution

芽孢杆菌属 GL1 中负责降解糖胺聚糖的不饱和葡萄糖醛酸水解酶的晶体结构，分辨率为 1.8Å

• 发表时间: 2004
• 期刊: Journal of Biological Chemistry 279(30)
• 作者: Wataru Hashimoto;Jinshan He;Takafumi Itoh
• 通讯作者: Takafumi Itoh

Masayuki Yamasaki: "Crystallization and preliminary X-ray analysis of alginate lyase, a member of polysaccharide lyase family PL-7, from Pseudomonas aeruginosa"Acta Crystallographica setion D. 59. 1499-1501 (2003)

Masayuki Yamasaki：“来自铜绿假单胞菌的藻酸盐裂解酶（多糖裂解酶家族 PL-7 的成员）的结晶和初步 X 射线分析”Acta Crystallographa 第 D. 59. 1499-1501 (2003)

Proteomics-based identification of outer-membrane proteins responsible for import of macromolecules in Sphingomonas sp.A1 : alginate-binding flagellin on the cell surface

基于蛋白质组学的鞘氨醇单胞菌 A1 负责输入大分子的外膜蛋白的鉴定：细胞表面的藻酸盐结合鞭毛蛋白

• 发表时间: 2005
• 期刊: Biochemistry 44・42
• 作者: Wataru Hashimoto