Drug Delivery System(DDS)を用いた新規粘膜ワクチン療法の開発

使用药物输送系统（DDS）开发新型粘膜疫苗疗法

• 批准号: 02J04538
• 负责人: 國澤 純
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02J04538/
• 关键词: Drug Delivery System; 抗原プロセッシング; 抗原提示; 粘膜免疫

SARSや鳥型インフルエンザをはじめとする新興・再興感染症が問題となっている昨今、遺伝子やペプチドを抗原として用いるワクチン療法が注目されている。免疫誘導能に優れたワクチンを創製するためには、抗原が適切な部位ならびに細胞へ送達されるだけではなく、送達された抗原が細胞内において適切にプロセッシングを受けた後、細胞表面でMHC分子を介して抗原提示されないといけない。抗原送達について我々はすでにDrug Delivery Systemを用いることで目的の抗原送達が可能で特に粘膜ワクチンへ応用可能なワクチンシステムを開発してきた。しかしながら後者の細胞内における抗原プロセッシングならびに抗原提示は十分に解明されたとは言い難いのが現状である。この分野における問題のひとつとして挙げられるのが、抗原プロセッシングの過程で生じる抗原中間体の検出が難しいことである。この問題を解決するために研究代表者らは生化学的な方法とT細胞ハイブリドーマ法を併せた抗原中間体同定法を開発した。本方法ではモデル抗原にニワトリ卵白アルブミン(OVA)を用いた。エピトープ(SIINFEKL)に含まれるのリジン(K)をヒスチジン(H)に変更し、エピトープのN末端とC末端のグルタミン酸(E)とスレオニン(T)をそれぞれリジン(K)に置換した変異型OVAを作製した。この3カ所の変異を導入することによりトリプシンとカルボキシペプチダーゼBの処理で変異型OVAから生じた中間体からエピトープが遊離し、特異的なT細胞ハイブリドーマと反応するようになった。さらに逆相HPLCを組み合わせることでそれぞれの中間体を個別に解析することも可能となった。また研究代表者はこの変異型OVAを発現する細胞を作製し、細胞内での抗原プロセッシングを検出・解析した。その結果、抗原中間体の大部分はエピトープのN末端のみにアミノ酸が結合した形で存在しており、そのプロセッシングにはプロテアソームと呼ばれる酵素が関与していることを証明した。またこれらの抗原中間体はペプチド単独としては存在せず、シャペロンと呼ばれる分子と結合していた。そのうちの一つであるTRiCをsmall interference RNAでノックダウンすると、結合している抗原中間体が分解され、その結果、細胞表面での抗原提示が減弱する事が判明した。以上、研究代表者は変異型OVAを用いることで簡便に抗原中間体を解析できるシステムを開発し、細胞内におけるシャペロンの重要性を示した。

近年来，SARS、禽流感等新发和再发传染病已成为一个问题，使用基因或肽作为抗原的疫苗疗法正引起人们的关注。为了制造出具有优异免疫诱导能力的疫苗，不仅需要将抗原递送到适当的部位和细胞，而且还要确保递送的抗原在细胞内经过适当的加工，然后在细胞上形成MHC分子。抗原必须通过细胞表面呈递。在抗原递送方面，我们已经开发了疫苗系统，可以利用药物递送系统递送目标抗原，特别适用于粘膜疫苗。然而，目前后者的细胞内抗原加工和抗原呈递尚未完全阐明。该领域的问题之一是难以检测抗原加工过程中产生的抗原中间体。为了解决这个问题，主要研究人员开发了一种结合生化方法和T细胞杂交瘤方法的抗原中间体鉴定方法。在该方法中，使用鸡卵清蛋白（OVA）作为模型抗原。表位(SIINFEKL)中所含的赖氨酸(K)变为组氨酸(H)，表位的N末端和C末端的谷氨酸(E)和苏氨酸(T)分别被替换为突变型OVA赖氨酸（K）被创建。通过引入这三个突变，在用胰蛋白酶和羧肽酶 B 处理后，突变 OVA 产生的中间体中释放出表位，使其能够与特定的 T 细胞杂交瘤发生反应。此外，通过结合反相HPLC，可以单独分析每个中间体。主要研究人员还创建了表达这种突变 OVA 的细胞，并检测和分析了细胞内抗原加工。结果表明，大多数抗原中间体以仅与表位 N 末端结合的氨基酸形式存在，并且一种称为蛋白酶体的酶参与了加工过程。此外，这些抗原中间体并不单独以肽形式存在，而是与称为伴侣的分子结合。研究发现，当使用小干扰RNA敲除其中一种TRiC时，结合的抗原中间体被降解，导致细胞表面上的抗原呈递减弱。如上所述，主要研究人员开发了一种可以使用突变 OVA 轻松分析抗原中间体的系统，并证明了细胞内伴侣的重要性。

项目成果

Sakaue G: "HIV Mucosal Vaccine : Nasal Immunization with gp160-encapsulated Hemagglutinating Virus of Japan-liposome induces antigen-specific CTLs and neutralizing antibody responses"J. Immunol.. 170(1). 495-502 (2003)

Sakaue G：“HIV 粘膜疫苗：用日本 gp160 封装的血凝病毒脂质体进行鼻免疫可诱导抗原特异性 CTL 并中和抗体反应”J.

Kunisawa J: "ワクチン療法におけるドラッグデリバリーシステムの応用 -ウイルスの技術応用-"わかる実験医学シリーズ ウイルス・細菌と感染症がわかる. 78-84 (2004)

Kunisawa J：“药物输送系统在疫苗治疗中的应用-病毒的技术应用-”了解实验医学系列：了解病毒、细菌和传染病78-84（2004）。

Sakaue G: "HIV Mucosal Vaccine : Nasal Immunization with gp160-encapsulated Hemagglutinating Virus of Japan-liposome induces antigen-specific CTLs and neutralizing antibody responses."J.Immunol.. 170(1). 495-502 (2003)

Sakaue G：“HIV 粘膜疫苗：用日本 gp160 封装的血凝病毒脂质体进行鼻免疫可诱导抗原特异性 CTL 和中和抗体反应。”J.Immunol.. 170(1)。