ジストロフィンmRNA前駆体のスプライシング促進配列に結合する核タンパクに関する研究

抗肌营养不良蛋白前体mRNA剪接促进序列结合核蛋白的研究

基本信息

批准号：
02F00252
负责人：
松尾雅文
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02F00252/
关键词：
DMD dystrophin splicing RNA binding protein

项目摘要

ジストロフィン遺伝子から転写されたmRNA前駆体は100kb以上もの巨大イントロンを有しており、そのスプライシングは非常に精密に制御されているものと考えられる。しかし、その機構を分子細胞生物学的手法を用いて明らかにした報告はない。本研究は、ジストロフィンmRNA前駆体に結合する核タンパクを分離精製し、その遺伝子をクローニングするとともに、発現させたタンパクを用いてスプライシング制御機序を明らかにするものである。ジストロフィン遺伝子の79のエクソンの中でエクソン19にスプライシング促進配列があることが明らかにされている。本研究では、まずエクソン19のスプライシング促進配列に結合する核タンパクの分離精製を行った。31塩基からなるエクソン19のスプラシシング促進配列からなるFAMラベルしたRNAプローブを作製した。これをHeLa細胞核抽出液と混ぜRNA・タンパク複合体をUVクロスリンク法を用いて作製した。さらに、HPLC法と電気泳動法を用いてこの複合体を単一バンドになるまで精製した。そして、この精製したバンドをTOFMAS分析し、プローブに結合した核タンパクの一部のアミノ酸配列を直接明らかにし、その結果からスプライシング促進配列に結合するタンパクの同定に成功した。この分離精製したタンパクのcDNAの全長をスクリーニングし、これをタンパク発現ベクターに組み込んだ。現在、本タンパク質の機能解析をミニ遺伝子を導入したHeLa細胞を応用した分子生物学的手法を用いて行っている。

从肌营养不良蛋白基因转录的mRNA前体具有超过100 kb的巨大内含子，其剪接被认为是高度精确控制的。但是，没有使用分子细胞生物学技术的这种机制的报道。这项研究分离并净化与肌营养不良蛋白mRNA前体，克隆基因的核蛋白，并使用表达的蛋白质来阐明剪接调节的机制。据揭示，肌营养不良蛋白基因的79个外显子中的外显子19中有一个剪接增强的序列。在这项研究中，首先分离并纯化了与外显子19的剪接增强序列结合的核蛋白。制备了由31个碱基Splaxis增强序列组成的外显子19的RNA探针。将其与HeLa细胞核提取物混合，并使用紫外线交联制备RNA-蛋白质复合物。另外，使用HPLC和电泳将复合物纯化为单个条带。然后通过Tofmas分析该纯化的条带，并直接揭示了与探针结合的某些核蛋白的氨基酸序列，从结果中，从结果中，蛋白质结合与剪接增强序列的结合已成功鉴定出来。筛选了分离的和纯化的蛋白质的cDNA的全长，并将其掺入蛋白质表达载体中。当前，使用已与微型烯转移的HeLa细胞的分子生物学技术对该蛋白进行了功能分析。