ジストロフィンmRNA前駆体に結合する新規核タンパクに関する分子生物学的研究

与肌营养不良蛋白前体 mRNA 结合的新型核蛋白的分子生物学研究

基本信息

批准号：
13877120
负责人：
松尾雅文
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

私たちは、Duchenne型筋ジストロフィーで遺伝子診断を精力的に実施し、ジストロフィンのスプライシング異常を示す多くの例を見出してきた。その中の1部の症例においては、スプライシングに関する古典的な概念で説明できない新しいスプライシング制御機序の存在が示唆された。そこで、私たちは未発見の核タンパクがスプライシングの制御に関与しているものと着想し、その核タンパクの存在について検討し、ジストロフィンmRNA前駆体に結合する新しい核タンパクの精製に成功した。精製した核タンパクのアミノ酸配列をTOF MASを用いて明らかにした。さらに、このアミノ酸配列と一致するタンパクをデータベースより検索した。その結果、mRNAと結合するタンパクとして2種の核タンパクがあることを明らかにした。そのcDNAの全塩基配列が明らかになったので、RT-PCR法を用いてcDNAをクローニングした。クローニングしたcDNA配列を発現ベクターに組み込み、これを大腸菌に導入することにより核タンパクを大量に得た。現在、タンパクのスプライシング反応における意義を明らかにするため、以下の実験を行っている。ジストロフィン遺伝子のミニ遺伝子を作成し、これを^<32>P-ATP存在下で転写させて^<32>PでラベルしたジストロフィンmRNA前駆体を作製する。これとHeLa細胞核抽出液とを混じてIn vitroでスプライシング反応を行う。そして、この系に先に合成した核タンパクをそれぞれ加え、スプライシング反応パターンを解析する。また、既知のタンパクを加えることによりそれぞれのタンパク間の相互作用も解析する。以上からmRNAに結合する核タンパクのスプライシング促進に果たす役割を解明する。

我们一直在积极进行Duchenne肌肉营养不良的遗传诊断，并发现许多肌营养不良蛋白剪接异常的例子。在其中一种情况下，提出了一种新的剪接调节机制，无法通过经典的剪接概念来解释。因此，我们认为未发现的核蛋白参与了剪接的调节，检查了核蛋白的存在，并成功纯化了一种与肌营养不良蛋白mRNA前体结合的新核蛋白。使用TOF MAS揭示了纯化的核蛋白的氨基酸序列。此外，从数据库中搜索了与该氨基酸序列相匹配的蛋白质。结果，揭示了有两种类型的核蛋白与mRNA结合。揭示了cDNA的整个碱基序列，并使用RT-PCR克隆了cDNA。将克隆的cDNA序列掺入表达载体中，并引入大肠杆菌以获得大量的核蛋白。目前，正在进行以下实验，以阐明蛋白质剪接反应的重要性。产生了肌营养不良蛋白基因的微基因，该基因在存在 ^<32> p-atp的情况下转录，以生成用 ^<32> p标记的肌营养不良蛋白mRNA前体。这与HeLa细胞核提取物混合，并在体外进行剪接。然后将先前合成的核蛋白添加到该系统中，以分析剪接反应模式。另外，通过添加已知蛋白质来分析每种蛋白质之间的相互作用。从以上，我们将阐明与mRNA结合在促进剪接中起作用的核蛋白的作用。