Identification of chemicals that enhance expression of myoblast growth factor Dp71ab

鉴定增强成肌细胞生长因子 Dp71ab 表达的化学物质

基本信息

批准号：
21K07875
负责人：
松尾雅文
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Kobe Gakuin University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

デュシェンヌ型筋ジストロフィー（D M D）は、進行性の筋萎縮症で筋芽細胞の枯渇による筋細胞の減少を特徴とする。筋芽細胞の増殖法の確立はD M Dの有力な治療法である。申請者は、ジストロフィンDp71の２エクソン欠失型アイソフォームであるDp71abが筋芽細胞の増殖因子であることを世界で初めて明らかにした。本研究は、Dp71abの産生を促すためエクソン７１と７８の２エクソンのスキッピングを同時に誘導する化合物を同定する。そのため、遠隔２エクソンのスプライシングを解析する２蛍光ミニ遺伝子を作製し、蛍光発光法を応用したハイスループット法によりその化合物を探索する。さらに、同定した化合物をヒト筋芽細胞に投与し、Dp71ab産生増加による細胞の増殖を明らかにする。その成果は、化合物を用いた筋芽細胞の増殖治療法の確立を大きく促進する。初年度において、遠隔２エクソンのスプライシングを解析する２蛍光ミニ遺伝子の作製を図った。すでにエクソンスキッピング検出を迅速容易にはかるmCherry赤色とeGFP緑色の2色蛍光発光ミニ遺伝子のFMv2を保有している。そこで、このFMv2をさらに改良し、遠隔２エクソンのスプライシングを同時にしかも定量的に解析する多エクソン２蛍光ミニ遺伝子の構築を目指した。まず、エクソン７１と７８の配列をそれぞれ別個にFMv2に挿入したミニ遺伝子を構築した。ところが、予想に反してエクソン７１と７８はともにスプライシングを受けなかった。これは、２つのエクソンがサイズの小さなミニエクソンであることに起因していると考え、FMv2に挿入する配列のサイズを変更したミニ遺伝子を各種作製し、最適のスプライシング解析系の構築を目指している。一方、DP71abが筋芽細胞特異的増殖因子であることを明らかにした成果をまとめ、論文として発表した。

杜氏肌营养不良症 (DMD) 是一种进行性肌肉萎缩症，其特征是由于成肌细胞耗竭导致肌肉细胞损失。建立成肌细胞增殖方法是治疗 DMD 的有效方法。申请人是世界上第一个证明 Dp71ab（抗肌营养不良蛋白 Dp71 的两个外显子缺失亚型）是成肌细胞生长因子的人。这项研究鉴定出一种化合物，它可以同时诱导两个外显子（外显子 71 和 78）的跳跃，从而促进 Dp71ab 的产生。为此，我们将创建两个荧光小基因来分析两个远距离外显子的剪接，并使用应用荧光的高通量方法来搜索化合物。此外，我们将向人类成肌细胞施用所鉴定的化合物，并证明由于 Dp71ab 产量增加而导致的细胞增殖。该结果将极大地促进使用化合物的成肌细胞增殖疗法的建立。第一年，我们的目标是创建两个荧光小基因来分析两个远距离外显子的剪接。它已经拥有FMv2，一种mCherry红和eGFP绿的双色荧光小基因，可以快速、轻松地检测外显子跳跃。因此，我们的目标是进一步改进FMv2，构建一个多外显子2荧光小基因，可以同时定量分析2个远距离外显子的剪接。首先，构建小基因，其中外显子71和78的序列分别插入FMv2中。然而，与预期相反，外显子71和78都没有发生剪接。我们认为这是由于两个外显子是小的迷你外显子，因此我们创建了插入FMv2的不同大小序列的各种迷你基因，旨在构建最佳的剪接分析系统。另一方面，我们总结了DP71ab是成肌细胞特异性生长因子的结果，并发表在论文中。