可逆性不死化ヒト肝細胞を用いたプロテオーム解析による不死化機構の研究

利用可逆永生化人肝细胞进行蛋白质组分析研究永生化机制

基本信息

批准号：
13877024
负责人：
米澤一仁
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞の不死化は生物学上の大きな問題であり、これから研究を推し進める必要のある重要分野である。初代培養ヒト肝細胞由来で、可逆性に不死化をコントロールできる細胞株NKN-T3細胞を用いて、可逆的に不死化をコントロールし、その時の蛋白質の変動をプロテオーム的アプローチにより網羅的に解析し、未知の不死化機構の解明を試みることが本研究の目的である。研究経過を以下に示すと、(1)NKN-T3細胞由来の蛋白質の同定を、2次元電気泳動法で試み、蛋白質同定に最適な2次元電気泳動法の条件の確立に成功した。が、可逆的に不死化に伴う蛋白質スポットの量の変動の再現性を得るのに困難を極め、結局この方法による変動蛋白質の同定は断念。(2)次に、NKN-T3細胞由来の蛋白質を分画し、SDS-PAGEによる一次元電気泳動での分離した。蛋白質のバンドを切り取りゲル内消化後、ESI-Q-TOF質量分析装置によるマスペプチドフィンガープリンテイング法による解析を行った。この手法により蛋白質を同定することに成功した。現在、NKN-T3細胞を不死化状態から増殖がとまる状態に転換することによって、いかなる蛋白質の発現変動が観察されるか検討中である。(3)また、このNKN-T3細胞は血清の存在、非存在下で肝細胞としての機能を喪失したり、回復したりという性質を有している。そこで、血清の存在、非存在下で細胞を処理し、その抽出物を(2)と同じ手法で解析し、現在変動する蛋白質の解析を行っている。

细胞永生化是一个主要的生物学问题，是一个重要领域，需要在将来促进。这项研究的目的是使用源自原发性培养的人肝细胞的NKN-T3细胞可逆地控制永生化，并可以使用蛋白质组学方法阐明未知的未知机制来全面地控制永生化，并可以全面地分析蛋白质的变化。研究进度如下所示：（1）使用二维电泳尝试鉴定源自NKN-T3细胞的蛋白质，并成功地确定了最佳蛋白质鉴定的二维电泳方法的条件。但是，很难重现与永生化相关的蛋白质斑点的数量，最后，使用这种方法鉴定可变蛋白质。（2）接下来，将源自NKN-T3细胞衍生的蛋白质分级，并通过SDS-PAGE通过一维电泳分离。切除蛋白质带并在凝胶中消化，然后使用ESI-Q-TOF质谱仪通过质量肽指纹进行分析。该技术已用于成功识别蛋白质。目前，我们正在研究通过将NKN-T3细胞从永生化到增殖来观察到蛋白质表达的变化。（3）此外，这些NKN-T3细胞具有在缺乏或没有血清的情况下失去或恢复其作为肝细胞功能的特性。因此，在存在或不存在血清的情况下处理细胞，并使用与（2）中相同的方法分析提取物以分析当前可变蛋白。