G1期における細胞成長・細胞周期を制御する分子に着目した新たながん治療法の研究

以控制G1期细胞生长和细胞周期的分子为重点的癌症治疗新方法研究

基本信息

批准号：
12217091
负责人：
米澤一仁
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

(1)免疫抑制剤ラパマイシンの細胞内標的蛋白mTORがアミノ酸バランスを感知し、蛋白合成系・細胞成長・細胞周期を制御する中心分子である事を示すため、高率にhomologous recombinationを起こすチキンB細胞DT40を用い、まず外来性のラットmTORをテトラサイクリンで発現を制御する系を作製。その細胞を使って、mTORのknockout細胞を作成しつつある。(2)アミノ酸のなかでもロイシンが、最も強くmTORの情報伝達系を活性化し、ロイシンのL体、アミノ基、側鎖が重要。ベータアラニンとリジンからなるmulti-antigen peptide(MAP)中のリジンのアルファ・イプシロンアミノ基に、8つのロイシン(L体)をカルボキシル基を介して結合させ、Leu8-MAPを合成。これは、分子量約2000で、細胞膜を通過できない。ラット肝癌細胞H4IIEをLeu8-MAPで刺激すると、mTOR下流のp70S6キナーゼが活性化される。この時Leu8-MAPの分解はほとんど観察されず、Leu8-MAPが細胞表面から作用したと思われた。(3)ロイシン誘導体中にロイシンによるp70S6キナーゼの活性化を阻害する化合物を発見。このロイシン誘導体の細胞増殖に対する効果は、ラパマイシン感受性ヒトT細胞であるJurkat細胞において、血清存在下で、細胞数増加を抑制、G1期で停止、サイクリンキナーゼ阻害因子p27Kip1の発現量の増加とretinoblastoma蛋白のリン酸化の低下を誘導。(4)mTORを介するシグナル系に関与する新規シグナル伝達分子の探索を行なうため、yeast two hybrid法と生化学的手法を用いた。mTORに対するモノクロナール抗体を作製し、この抗体のアフィニティカラムで、mTORを精製、共に精製されてくる蛋白を発見。現在、解析を行なっている。

（1）引起高同源重组率的鸡B表明，免疫抑制剂雷帕霉素的细胞内靶蛋白mTOR是感知氨基酸平衡并控制蛋白质合成系统、细胞生长和细胞周期的中心分子使用细胞 DT40，我们首先创建了一个用四环素控制外源性大鼠 mTOR 表达的系统。他们正在使用这些细胞来创建 mTOR 敲除细胞。 (2)氨基酸中，亮氨酸对mTOR信号转导系统的激活作用最强，亮氨酸的L型、氨基和侧链很重要。 Leu8-MAP 是通过将 8 个亮氨酸（L 型）通过羧基与由 β-丙氨酸和赖氨酸组成的多抗原肽 (MAP) 中赖氨酸的 α-ε 氨基连接而合成的。它的分子量约为2000，不能穿过细胞膜。用 Leu8-MAP 刺激大鼠肝癌细胞 H4IIE 可激活 mTOR 下游的 p70S6 激酶。此时，几乎没有观察到Leu8-MAP的降解，表明Leu8-MAP从细胞表面起作用。 (3)在亮氨酸衍生物中发现了一种化合物，可抑制亮氨酸激活p70S6激酶。这种亮氨酸衍生物对细胞增殖的影响是，在血清存在下，Jurkat细胞（雷帕霉素敏感的人T细胞）抑制细胞数量增加，停滞在G1期，细胞周期蛋白激酶抑制剂p27Kip1和视网膜母细胞瘤蛋白的表达增加引起磷酸化的减少。 (4)为了寻找参与mTOR介导的信号系统的新的信号分子，我们采用了酵母二杂交法和生化法。我们创建了一种针对 mTOR 的单克隆抗体，使用该抗体的亲和柱纯化了 mTOR，并发现了一种共纯化的蛋白质。目前正在进行分析。