哺乳細胞におけるシグナル伝達機構解明のためのプロテオーム解析の基盤研究

蛋白质组分析基础研究，阐明哺乳动物细胞信号转导机制

基本信息

批准号：
13206047
负责人：
米澤一仁
金额：
$ 4.61万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

哺乳動物でのシグナル伝達機構を網羅的に明らかにするためのプロテオーム的研究手法の基盤研究を行うため、我々が以前より研究を行っている『哺乳細胞において、次世代の免疫抑制剤であるラパマイシンの漂白蛋白mTORキナーゼを解するシグナル伝達系が、細胞を取り巻く環境中のアミノ酸バランスを感知し、細胞増殖因子と共に、細胞機能を制御している』という生命現象を対象とした実験を行った。研究経過を以下に示すと、(1)まず、ラパマイシン処理により変動する蛋白質の同定を、2次元電気泳動法で試み、蛋白質同定に最適な2次元電気泳動法の条件の確立に成功した。が、蛋白質スポットの量の変動の再現性を得るのに困難を極め、結局この方法による変動蛋白質の同定は断念。(2)そこで、mTORに結合する新規蛋白の精製とその同定を試みた。アフィニティーカラム等を用いた蛋白精製により、mTORに結合している可能性のある複数の蛋白の同定に成功。(3)そのうちのp150を質量分析装置を用いたマスフィンガープリンテイング法で分析し、遺伝子を同定。その全長cDNA配列の決定を行い、機能解析のために発現ベクターの作成、抗体の作成を行った。(4)アミノ酸配列の結果から、p150はC末端側にWD-repeat構造を持つ蛋白であることが判明。(5)機能解析の結果、(1)mTORとp150は細胞内で恒常的に結合。(2)p150はmTORのリン酸化酵素活性を4〜5倍上昇させる。(3)p150は翻訳に関わるp70S6kinas6(p70)やeIF-4EBP1(4EBP1)とも結合し、mTORと4量体を形成。(4)p150の過剰発現により、細胞内でp70と4EBP1の活性化/リン酸化が強く阻害される。以上の結果は、p150はmTORに対するscaffold蛋白として機能し、mTORからp70や4EBP1へのシグナル伝達に必須の分子であることを示している。

为了开展蛋白质组学研究方法的基础研究，全面阐明哺乳动物的信号转导机制，我们一直在针对哺乳动物细胞中的生物现象进行了下一代免疫抑制剂雷帕霉素的开发研究。由漂白蛋白 mTOR 激酶介导的信号转导系统感知细胞周围环境中的氨基酸平衡，并与细胞生长因子一起控制细胞功能。研究进展如下：（1）首先，我们尝试利用二维电泳鉴定随雷帕霉素处理而变化的蛋白质，并成功建立了二维电泳蛋白质鉴定的最佳条件。然而，获得蛋白质斑点数量波动的重现性极其困难，最终我们放弃了使用这种方法鉴定波动蛋白质。 (2)因此，我们尝试纯化并鉴定一种与mTOR结合的新蛋白。通过使用亲和柱纯化蛋白质，我们成功鉴定了多种可能与 mTOR 结合的蛋白质。 (3)其中，使用质谱仪对p150进行质量指纹分析，并鉴定了该基因。确定了全长 cDNA 序列，并创建了表达载体和抗体用于功能分析。 (4)从氨基酸序列结果来看，p150是C端具有WD重复结构的蛋白质。 (5)功能分析的结果是，(1)mTOR和p150在细胞内持续相连。 (2) p150 使 mTOR 激酶活性增加 4-5 倍。 (3) p150 还与参与翻译的 p70S6kinas6 (p70) 和 eIF-4EBP1 (4EBP1) 结合，并与 mTOR 形成四聚体。 (4)p150的过表达强烈抑制细胞中p70和4EBP1的激活/磷酸化。这些结果表明p150充当mTOR的支架蛋白，并且是从mTOR到p70和4EBP1的信号转导的必需分子。