アミノ酸バランスを感知し、細胞機能を制御するシステムのプロテオーム解析

感知氨基酸平衡和控制细胞功能的系统的蛋白质组分析

基本信息

批准号：
12206056
负责人：
米澤一仁
金额：
--
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

(1)プロテオーム解析系の確立:部分精製蛋白質や哺乳細胞のlysate・細胞分画をSDS-PAGEによる1次元電気泳動、あるいは等電点電気泳動と・SDS-PAGEによる2次元電気泳動で展開し、蛋白を分離、染色を施す。スポットを切り出し消化後、得られたペプチドをハイブリッド型質量分析計(Q-TOF)あるいはMALDI-TOF型質量分析計で解析し、検出された質量の値を用いてデータベースから蛋白を同定するという蛋白質のプロテオーム解析系を確立した。MS/MS法を用いたアミノ酸配列の決定法も確立した。(2)アミノ酸バランスの変化に伴う蛋白発現変動のプロテオーム解析:哺乳細胞をアミノ酸を含む、または含まない培養液で処理後、上記の要領でプロテオーム解析を行なった。しかし、細胞のlysateや細胞分画をサンプルとした場合、画像解析システムで量的変動がみられるスポットはごくわずかであり、また再現性に問題があり、改善が必要と思われた。(3)アミノ酸バランスの変化に伴うmTORの翻訳後修飾の解析:リン酸化されたmTORを消化し、質量分析計で分析。質量変化に基づき複数のリン酸化部位を同定した。このリン酸化部位に点変異を導入し、mTOR機能に及ぼす影響を検討中である。(4)今後の展望哺乳細胞のlysateを2次元電気泳動で分離し、その量的変動を捕らえることはかなり困難であると思われる。今後は、全体の蛋白を相手にするのではなく、ある基準を決定し、それに合致した蛋白群・翻訳後修飾にfocusし、解析法を考える必要性がある。たとえば、アミノ酸変動に伴うリン酸化蛋白質にfocusした解析などを開発していく予定である。

（1）蛋白质分析的建立：精神细胞的部分精制蛋白和裂解物 /细胞分裂由SDS-PAGE部署，或相等的电泳和等效的电动游泳，以及通过SDS-PAGE进行的二维电泳。。一种蛋白质，可以用杂化型规范计（Q-TOF）或MALDI-TOF-TOF-TOF-tof-tof-tof-tof-tof-tof质量值鉴定蛋白质的蛋白质。。还建立了使用MS/MS方法的氨基酸序列方法。（2）由于氨基酸平衡的变化而引起的蛋白质表达波动的蛋白质分析：在上述海报中，在处理母体细胞（或不包括或不包括）后，在上述海报中进行了strotot ohm分析。但是，如果将细胞用作细胞和细胞分裂的样本，则在图像分析系统中只有几个斑点可以看到定量波动，并且存在可重复性的问题，并且人们认为需要改进。（3）MTOR在MTOR翻译后由于氨基酸平衡的变化而引起的MTOR：消化的磷酸化mTOR并用质量规格计分析。根据质量变化鉴定了多个磷酸化位点。我们正在通过对该磷酸化位点引入功能障碍来检查MTOR功能的影响。（4）似乎很难用两维电动游泳并捕获定量波动，将未来天文台的普通话细胞的裂解物分开。将来，有必要确定某个标准，而不是处理整体蛋白质，重点以匹配蛋白质群，翻译后翻译并考虑分析方法。例如，我们计划开发一种分析，该分析集中于与氨基酸波动相关的磷酸化蛋白质。