アミノ酸バランスを感知し、細胞機能を制御するシステムのプロテオーム解析

感知氨基酸平衡和控制细胞功能的系统的蛋白质组分析

基本信息

批准号：
12206056
负责人：
米澤一仁
金额：
--
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

(1)プロテオーム解析系の確立:部分精製蛋白質や哺乳細胞のlysate・細胞分画をSDS-PAGEによる1次元電気泳動、あるいは等電点電気泳動と・SDS-PAGEによる2次元電気泳動で展開し、蛋白を分離、染色を施す。スポットを切り出し消化後、得られたペプチドをハイブリッド型質量分析計(Q-TOF)あるいはMALDI-TOF型質量分析計で解析し、検出された質量の値を用いてデータベースから蛋白を同定するという蛋白質のプロテオーム解析系を確立した。MS/MS法を用いたアミノ酸配列の決定法も確立した。(2)アミノ酸バランスの変化に伴う蛋白発現変動のプロテオーム解析:哺乳細胞をアミノ酸を含む、または含まない培養液で処理後、上記の要領でプロテオーム解析を行なった。しかし、細胞のlysateや細胞分画をサンプルとした場合、画像解析システムで量的変動がみられるスポットはごくわずかであり、また再現性に問題があり、改善が必要と思われた。(3)アミノ酸バランスの変化に伴うmTORの翻訳後修飾の解析:リン酸化されたmTORを消化し、質量分析計で分析。質量変化に基づき複数のリン酸化部位を同定した。このリン酸化部位に点変異を導入し、mTOR機能に及ぼす影響を検討中である。(4)今後の展望哺乳細胞のlysateを2次元電気泳動で分離し、その量的変動を捕らえることはかなり困難であると思われる。今後は、全体の蛋白を相手にするのではなく、ある基準を決定し、それに合致した蛋白群・翻訳後修飾にfocusし、解析法を考える必要性がある。たとえば、アミノ酸変動に伴うリン酸化蛋白質にfocusした解析などを開発していく予定である。

（1）建立蛋白质组分析系统：哺乳动物细胞的部分纯化的蛋白质和裂解物和细胞部分是通过使用SDS-PAGE的一维电泳来开发的，或使用SDS-PAGE进行SDS-PAGE或使用SDS-PAGE的二维电泳，并分离并分离蛋白质。切除并消化斑点后，使用杂化质谱仪（Q-TOF）或MALDI-TOF型质谱仪分析获得的肽，并建立了蛋白质蛋白质组学分析系统，其中使用检测到的质量值从数据库中鉴定出蛋白质。还已经建立了一种使用MS/MS方法确定氨基酸序列的方法。（2）与氨基酸平衡变化相关的蛋白质表达变异的蛋白质组学分析：在使用或不使用氨基酸的哺乳动物细胞后，在上述过程中进行了蛋白质组学分析。但是，当使用细胞裂解物或细胞级分作为样品时，在图像分析系统中观察到定量波动的地方很少，并且可重复性也有问题，因此认为有必要进行改进。（3）分析由于氨基酸平衡的变化而导致的MTOR的翻译后修饰：使用质谱仪消化并分析了磷酸化的MTOR。根据质量变化，鉴定了多个磷酸化位点。目前正在研究该磷酸化位点上引入点突变对MTOR功能的影响。（4）未来的前景可能很难通过二维电泳分离哺乳动物细胞裂解物并捕获定量变化。从现在开始，不再关注整个蛋白质，而是必须确定某些标准，专注于蛋白质群和匹配它的翻译后修饰，并考虑一种分析方法。例如，我们计划对与氨基酸波动相关的磷酸化蛋白质进行重点分析。