アポトーシスにおけるミトコンドリア膜透過性亢進因子の同定とその分子機構の解明

细胞凋亡中线粒体膜通透性增强剂的鉴定及其分子机制的阐明

基本信息

批准号：
13216061
负责人：
清水重臣
金额：
$ 4.03万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13216061/
关键词：
アポトーシスミトコンドリア Bid Bik シトクロムC

项目摘要

アポトーシスシグナル伝達機構においてミトコンドリアの膜透過性亢進現象は重要な役割を担っている。この膜透過性機構を解明する上で、1)ミトコンドリア膜透過性亢進因子の同定、2)Bcl-2ファミリーのミトコンドリア上のターゲット分子の同定、は重要な課題である。1)ミトコンドリア膜透過性亢進因子の同定-X線を照射したラット胸腺より細胞質画分を調整しラット肝から単離したミトコンドリアと混和すると、ミトコンドリアからのシトクロムc漏出が確認された。この作用は正常胸腺の細胞質画分では認められなかった。FPLCを用いてこの因子の単離精製を行い、アミノ酸シークエンスにより蛋白質の同定を行った。その結果、本蛋白質は既知のBax, Noxa, P53AIP1とは異なる蛋白質であった。実際に、(A)本蛋白質のリコンビナントを作製して単離ミトコンドリアに添加したところ、種々のpro-apoptotic蛋白質よりも強いシトクロムc漏出誘導能を有していた。また、(B)X線照射後の胸腺細胞質から本蛋白質を免疫除去し単離ミトコンドリアに添加したところ、シトクロムc漏出誘導活性は消失した。さらに、(C)本蛋白質は正常状態では細胞質中にほとんど観察されなかったが、X線照射後経時的に細胞質含量が増加した。これらの結果は、我々が同定した蛋白質がX線誘導性アポトーシスのシグナル伝達において必須の分子であることを示唆している。2)Bcl-2ファミリーのミトコンドリア上のターゲヅト分子の同定-Bcl-2ファミリーのうちpro-apoptoticに作用するBid/Bikに結合する蛋白質を免疫沈降法やyeast two hybrid法等を用いて探索した。その結果、Bid結合蛋白質として3種類、Bik結合蛋白質として1種類のミトコンドリア蛋白質を同定した。

线粒体膜通透性过高现象在细胞凋亡信号转导机制中发挥着重要作用。在阐明这种膜通透性机制时，重要的问题是1）线粒体膜通透性增强因子的鉴定，2）线粒体上Bcl-2家族靶分子的鉴定。 1)线粒体膜通透性增强剂的鉴定-当从X射线照射的大鼠胸腺制备细胞质级分并将其与从大鼠肝脏分离的线粒体混合时，证实了细胞色素c从线粒体渗漏。在正常胸腺的细胞质部分中没有观察到这种效应。使用FPLC分离和纯化该因子，并通过氨基酸测序鉴定蛋白质。因此，该蛋白与已知的 Bax、Noxa 和 P53AIP1 不同。事实上，(A) 当制备该蛋白的重组体并将其添加到分离的线粒体中时，它比各种促凋亡蛋白具有更强的诱导细胞色素 c 渗漏的能力。 (B) 当这种蛋白质在 X 射线照射后从胸腺细胞质中免疫去除并添加到分离的线粒体中时，细胞色素 c 渗漏诱导活性消失。此外，(C)在正常条件下在细胞质中几乎观察不到该蛋白质，但在X射线照射后细胞质含量随着时间的推移而增加。这些结果表明我们鉴定的蛋白质是 X 射线诱导的细胞凋亡信号转导中的重要分子。 2) Bcl-2家族线粒体上靶分子的鉴定-我们使用免疫沉淀和酵母两种混合方法寻找与Bid/Bik结合的Bcl-2家族蛋白质，其具有促凋亡作用。结果，我们鉴定出三种类型的线粒体蛋白作为 Bid 结合蛋白，一种类型的线粒体蛋白作为 Bik 结合蛋白。