ナノプローブ走査型顕微システムによる細胞内分子ネットワークの解析

使用纳米探针扫描显微镜系统分析细胞内分子网络

基本信息

批准号：
13206025
负责人：
民谷栄一
金额：
$ 3.52万
依托单位：
Japan Advanced Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

申請者らは、ナノ領域の観測を可能とする近接場顕微鏡を駆使し、細胞内や表層で発現するGF分子や細胞表面に局在するレセプター分子などを高空間分解能でイメージングするナノプロープ顕微鏡システムや近接場観測技術とチップ技術と連携したリアルタイムイメージングシステムを開発し、最終的にはゲノム情報にもとずいた細胞内で発現する生化学ネットワークの解析を可能とするシステムの構築を行なう。(1)ナノ空間イメージングシステムによる生体解析光ファイバープローブ先端の微小開口近傍に形成される近接場のエバネッセント光や共焦点顕微測定を基礎として蛍光分子の局所領域の状態を解析することが可能となる。測定対象とする細胞内発現プロープ分子としてターゲットサイトに融合タンパクとして発現させたGFP分子を用いた。具体的には、枯草菌や酵母菌で発現させたGFP分子をイメージングし、発現の空間プロファイルを作製する。まず、GFPを細胞表層蛋白質として発現させたSaccharomyces cerevisiaeを用いてグルコース添加後の時間経過ごとの蛍光変化より細胞内部から細胞表層へGFP融合表層タンパク質の発現の様子を観察した。次にSNOAM(走査型近接場光/原子間力顕微鏡)を用いて観察したところ、酵母細胞の3次元形状と細胞の蛍光像の同時観測に成功した。次に、DnaB-GFPおよびYqeH-GFPを導入したBacillus subtilisのGFP発現の時間経過のイメージングを可能とした。(2)リアルタイムナノスコピック顕微システムの構築上記のシステムは、空間分解能に優れた測定装置であるが、プロープを走査する時間を要するため、イメージングに分オーダーを要し、リアルタイム測定には向かない。そこで、細胞での局在情報をリアルタイムに測定する方法として新たに全反射型の蛍光顕微システムを試作する。`これにより、エバネッセント励起が可能なナノ領域のみの化学情報が得られるだけでなく、ミリ秒単位でイメージングが可能となる。これを用いてDNAやプロテインのライブラリーを集積配置したチップ上における動的挙動の解析を検討した。1000-10000チャンネルを有するマイクロチャンバーアレイと近接場光顕微鏡を連携したシステムを構築し、DNAのハイブリダイゼーションや抗原抗体反応をリアルタイムに測定することを可能とした。

Using near-field microscopes that allow observation of nano-regions, the applicants will develop a nanoprobe microscope system that image GF molecules expressed in cells and surface layers, receptor molecules localized on the cell surface, and a real-time imaging system that collaborates with near-field observation technology and chip technology, ultimately building a system that allows analysis of biochemical networks expressed in cells based on genomic information. （1）使用纳米空间成像系统的生物学分析，可以使用近场逃生光和共聚焦显微镜分析荧光分子的局部区域，这些状态在光纤维探测的光纤维尖端的微观开放附近形成。在目标位点表达为融合蛋白的GFP分子用作测量的细胞内表达探针分子。具体而言，在枯草芽孢杆菌或酵母中表达的GFP分子成像以创建表达的空间特征。首先，使用酿酒酵母（将GFP表示为细胞表面蛋白），我们根据葡萄糖添加后的荧光随时间变化，观察到GFP融合表面蛋白从细胞内到细胞表面的表达。接下来，当我们使用SNOAM（扫描近场光/原子力显微镜）观察时，我们能够同时观察酵母细胞的三维形状和细胞的荧光图像。接下来，可以在枯草芽孢杆菌中对GFP表达的时间过程进行成像，该时间是用DNAB-GFP和YQEH-GFP引入的。（2）构建实时纳米镜面微系统上述系统是一种具有出色空间分辨率的测量设备，但是需要时间来扫描探针，因此需要大量的订购来进行成像，并且不适合实时测量。因此，生成了一种新的总反射荧光微系统作为实时测量细胞中的定位信息的一种方法。 `这不仅为纳米区域提供了化学信息，可以激发人们激发，而且还允许以毫秒为单位进行成像。使用此过程，我们研究了在芯片上分析DNA和蛋白质文库的芯片上的动态行为。构建了一个系统，该系统将微培训阵列与1000-10,000个通道与近场光显微镜结合在一起，从而实时测量DNA杂交和抗原抗体反应。