ナノプローブ走査型顕微システムによる細胞内分子ネットワークの解析

使用纳米探针扫描显微镜系统分析细胞内分子网络

基本信息

批准号：
13206025
负责人：
民谷栄一
金额：
$ 3.52万
依托单位：
Japan Advanced Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

申請者らは、ナノ領域の観測を可能とする近接場顕微鏡を駆使し、細胞内や表層で発現するGF分子や細胞表面に局在するレセプター分子などを高空間分解能でイメージングするナノプロープ顕微鏡システムや近接場観測技術とチップ技術と連携したリアルタイムイメージングシステムを開発し、最終的にはゲノム情報にもとずいた細胞内で発現する生化学ネットワークの解析を可能とするシステムの構築を行なう。(1)ナノ空間イメージングシステムによる生体解析光ファイバープローブ先端の微小開口近傍に形成される近接場のエバネッセント光や共焦点顕微測定を基礎として蛍光分子の局所領域の状態を解析することが可能となる。測定対象とする細胞内発現プロープ分子としてターゲットサイトに融合タンパクとして発現させたGFP分子を用いた。具体的には、枯草菌や酵母菌で発現させたGFP分子をイメージングし、発現の空間プロファイルを作製する。まず、GFPを細胞表層蛋白質として発現させたSaccharomyces cerevisiaeを用いてグルコース添加後の時間経過ごとの蛍光変化より細胞内部から細胞表層へGFP融合表層タンパク質の発現の様子を観察した。次にSNOAM(走査型近接場光/原子間力顕微鏡)を用いて観察したところ、酵母細胞の3次元形状と細胞の蛍光像の同時観測に成功した。次に、DnaB-GFPおよびYqeH-GFPを導入したBacillus subtilisのGFP発現の時間経過のイメージングを可能とした。(2)リアルタイムナノスコピック顕微システムの構築上記のシステムは、空間分解能に優れた測定装置であるが、プロープを走査する時間を要するため、イメージングに分オーダーを要し、リアルタイム測定には向かない。そこで、細胞での局在情報をリアルタイムに測定する方法として新たに全反射型の蛍光顕微システムを試作する。`これにより、エバネッセント励起が可能なナノ領域のみの化学情報が得られるだけでなく、ミリ秒単位でイメージングが可能となる。これを用いてDNAやプロテインのライブラリーを集積配置したチップ上における動的挙動の解析を検討した。1000-10000チャンネルを有するマイクロチャンバーアレイと近接場光顕微鏡を連携したシステムを構築し、DNAのハイブリダイゼーションや抗原抗体反応をリアルタイムに測定することを可能とした。

申请人将利用能够在纳米域进行观察的近场显微镜来开发纳米探针显微镜系统和纳米探针显微镜系统，该系统将对细胞内部和表面表达的GF分子以及位于细胞表面的受体分子进行成像我们将开发一种结合近场观察技术和芯片技术的实时成像系统，最终构建一个能够根据基因组信息分析细胞内表达的生化网络的系统。 (1)使用纳米空间成像系统的生物分析基于近场倏逝光和在光纤探针尖端的显微孔径附近形成的共焦显微测量，可以分析荧光分子的局部区域的状态。使用在靶位点表达为融合蛋白的GFP分子作为待测量的细胞内表达探针分子。具体来说，我们将对枯草芽孢杆菌或酵母中表达的 GFP 分子进行成像，并创建表达的空间概况。首先，使用表达GFP作为细胞表面蛋白的酿酒酵母，通过观察添加葡萄糖后随时间的荧光变化，观察从细胞内部到细胞表面的GFP融合表面蛋白的表达状态。接下来，使用SNOAM（扫描近场光学/原子力显微镜），我们成功地同时观察了酵母细胞的三维形状和细胞的荧光图像。接下来，我们能够对引入 DnaB-GFP 和 YqeH-GFP 的枯草芽孢杆菌中 GFP 表达的时间过程进行成像。 (2)实时纳米显微系统的构建上述系统是一种具有优异空间分辨率的测量装置，但由于扫描探针需要时间，成像需要几分钟的时间，不适合实时测量。因此，我们将设计一种新的全内反射荧光显微镜系统作为实时测量细胞中定位信息的方法。 “这不仅使我们能够仅在可能瞬逝激发的纳米区域获得化学信息，而且还能够在几毫秒内进行成像。利用这一点，我们研究了集成 DNA 和蛋白质库的芯片上的动态行为分析。我们构建了一个连接具有 1000-10000 个通道的微室阵列和近场光学显微镜的系统，使得实时测量 DNA 杂交和抗原抗体反应成为可能。