ナノプローブ走査型顕微鏡システムによる細胞内分子ネットワークの解析

使用纳米探针扫描显微镜系统分析细胞内分子网络

基本信息

批准号：
12206036
负责人：
民谷栄一
金额：
--
依托单位：
Japan Advanced Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12206036/
关键词：
GFP SNOM AFM 酵母

项目摘要

申請者らは、走査型プローブ顕微鏡と近接場顕微鏡を連携したシステムにより、細胞内で発現するGFP(Green Fluorescent Protein)分子や細胞表面に局在するレセプター分子などを10ナノメートルレベルの空間分解能でイメージングすることに成功しており、ゲノム情報にもとずいた細胞内で発現する生化学ネットワークを細胞内外のナノ空間情報と連携させて解析することを確立する。そこで、今回は、グルコースの存在下でGFPを発現するGFP形質転換酵母の時間経過にともなうGFP融合タンパク質の挙動をSNOAM(走査型近接場光/原子間力顕微鏡)システムを用いて解析することを検討した。まず、SD-W培地20℃でGFP形質転換酵母を培養した。対数増殖期の酵母細胞を分取し、レーザー共焦点顕微鏡にて励起光488nmを照射し、グルコース添加後の酵母細胞の蛍光像の経時的変化を観察した。同様に対数増殖期の酵母細胞を分取し、SNOAMにて観察した。GFP形質転換酵母の共焦点顕微鏡による観察によって、グルコース添加後の時間経過ごとの蛍光変化より細胞内部から細胞表層へGFP融合表層タンパク質の発現の様子が観察された。この発現の観察では細胞表面の蛍光に強弱がみられた。このことからGFP目的タンパク質である細胞表層タンパク質が、細胞表層で局在していることが認められた。また、細胞の分裂周期によってこの表層タンパク質の局在が異なることが観察された。この局在の詳細は、既存の共焦点顕微鏡では観察できなかった。そこでSNOAMを用いて観察したところ、酵母細胞の形状および蛍光像が得られた。

申请人具有10纳米水平的空间分辨率，能够具有GFP（绿色荧光蛋白）分子和受体分子，这些分子在细胞中表达，并通过扫描显微镜和接近的系统表达在细胞中的受体分子 - - 图像链接已成功，并建立了与纳米空间信息在细胞内外合作的细胞中表达的生化网络。因此，这次，我认为GFP融合蛋白在葡萄糖的存在中表达GFP的行为是使用SNOAM（扫描关闭的光/互连功率显微镜）系统分析的。首先，在SD-W培养基上在20°C培养GFP转化的酵母。分布在对数增殖期间的酵母细胞，并用显微镜用488 nm的激发光照射激光，并观察到添加葡萄糖后酵母细胞荧光的加班变化。同样，在对数增殖期间分布并在SNOAM上观察到酵母细胞。 GFP转化的酵母的CO-焦点显微镜观察，GFP融合高的纹料的表达从细胞表面层到细胞表面层从荧光变化中添加后，加入了荧光变化。在观察该表达时，细胞表面上的荧光强度且弱。结果，人们认识到，是GFP蛋白的细胞蛋白位于细胞表面层中。还观察到，该表面蛋白的位置取决于细胞的激烈循环。现有的CO -Cocus显微镜无法观察到此位置的细节。因此，当使用SNOAM观察时，获得了酵母细胞的形状和荧光。