銅タンパク質の電子メディエーター機能に関する研究

铜蛋白电子介体功能的研究

基本信息

批准号：
06226230
负责人：
民谷栄一
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Japan Advanced Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、銅イオンを活性中心に有するオキシダーゼであり、アミノ酸残基が直接電子授受を行う重要なサイトとして考えられているガラクトースオキシダーゼ(GAO)を用いて、その酸化還元反応を電気化学的に制御すると共に、電子伝達機能の解析を行うことを検討した。まず、GAOと電子授受を行うメディエーターを選択するために、1-Methoxy PMS,Meldolas'Blue,p-Bezoquinone,Ferrocenylmethyl-trimethylammonium bromide,Ferrocene monocarboxylic aciなどを検討した。その結果、Ferrocene monocarboxylic acidをpH9の緩衝液中で用いた場合、良好なメディエーターとして機能することが明らかとなった。Ferrocenylmethyl trimethylammonium bromideも電流の増加を示したが酸素の酸化電流の影響を受けやすい電位であるため明確なメディエーター機能を認めることはできなかった。なお、その他のメディエーターとGAOとの電子授受は観測されなかった。次に、Ferrocene monocarboxylic acidを用いてk_f/a vs. 1/sプロットによりk_f(pseudo-first-order rate constant)及びk_s(=k_f/[z])(homogeneous second-order rate constant)を算出したところ、k_f=65.2s^<-1>,k_s=13.0x10^5l mol^<-1> s^<-1>の値が得られた。なおGAOはpH=6付近に酵素活性の最大が認められるが、Ferrocene monocarboxylic acidを用いた場合にはpHが6及び7の時には、メディエーター機能を示さなかった。このことは、Ferrocene monocarboxylic acidとGAOとの相互作用のpH依存性を反映している。Ferrocene monocarboxylic acidがメディエーター機能を示したpH=9の状態は本来の酵素の最適条件とは異なり若干変性した状態とも考えられる。そこで積極的に変性剤を用いてGAOに構造変化を与え、メディエーターとの電子授受への影響について調べた。そこで変性剤として塩酸グアニジンを用い、変性剤の濃度を変化させることによりGAOの構造変化にともなう、I_k(kinetically-controlled current)/I_d(diffusion-controlled current)の変化を測定した。その結果、1Mの塩酸グアニジンを共存させたところ、10%以下にI_k/I_d値が減少した。そこで次にGAOの反応基質としてガラクトースの代わりに3-Methoxybenzyl alcoholを用いて同様の実験を行ったところ、1Mの塩酸グアニジンを共存下でも未変性時の約30%のI_k/I_d値を保持した。このことは基質に対する酵素の反応特異性が変性過程で異なることを示すと考えられた。

在这项研究中，氧化酶主要在铜离子中活跃，氨基酸残基被认为是直接提供电子调节的重要位点，氧化反应反应是电化学的。首先，要选择一个执行GAO，1-甲氧基PM，Meldolas'bl-三甲基铵剂的介体，我们认为是LIC ACI。结果，可以发现，如果在PH9缓冲液中使用了二硫化单核酸，它将用作良好的介体。甲基甲基甲基三甲基铵溴溴也表明电流增加，但无法识别清晰的介体功能，因为它是氧的潜力，它很容易受到氧气的影响。未观察到其他调解人和高ga。接下来，k_f/a vs. 1/s绘图到k_f（pseudo-torst-saturer速率consant）和k_s（= k_f/[z]）计算的速率个块），但是，k_f = 65.2s^<-1>的值，k_s = 13.0x10^5l mol^<-1> s^<-1>。 GAO中的最大酶活性在pH = 6附近识别出，但是当使用二循环单羧酸时，pH为6和7时，并不表示介体功能。这反映了二茂二羧酸和GAO之间相互作用的pH依赖性。 pH = 9个状态，其中二硫化单核酸表明介体功能被认为与原始酶最佳条件略有不同。因此，我们积极地使用变态来将结构变化更改为GAO，并研究电子奖励与调解人的影响。因此，I_K（Kineticaly-Controlled电流）/I_D（扩散控制电流）的变化被用作变质盐酸盐，以通过改变变质的浓度来改变变质的浓度来改变变质的浓度。结果，1M盐酸盐共存并存，I_K/I_D值降至10％或更少。因此，作为GAO反应底物，使用3-甲氧基苄基醇代替半乳糖进行了类似的实验，而在纪念时，盐酸Ghnidin盐酸的1 m盐酸含量约为I_K/I_D值的30％。人们认为这表明酶对底物的反应特异性在变性程度上有所不同。