ベンゾピレン分解微生物の分子機構とバイオレメディエーションのための遺伝子およびバイオセンサーの開発

苯并芘降解微生物的分子机制以及生物修复基因和生物传感器的开发

基本信息

批准号：
01F00113
负责人：
民谷栄一
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Japan Advanced Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

Benzo[a]pyrene(B[a]P)は、5個のベンゼン環からなる多環式芳香族炭化水素(PAH)であり、発ガン性、突然変異誘発性、および内分泌腺撹乱作用を有する難分解性物質である。また、B[a]Pは土壌中など自然環境中に存在するが、その性質から微生物による分解が困難である。そのため、B[a]P分解微生物の報告例は少なく、B[a]P分解酵素やその代謝経路についても明らかにされていない。そこで、本研究において、B[a]P分解菌Paenibacillus sp. B2-1株からB[a]P分解酵素の探索を行い、その特性評価を行うとともに、B[a]Pの分解代謝経路について考察を行った。まず、B[a]Pのみを炭素源とした寒天培地上で、Paenibacillus sp. B2-1株の前培養を行った。前培養により得られた菌体を0.2ppmのB[a]Pを含んだ液体培地に植菌し、25℃、110rpmの条件下で4日間、大量培養を行った。この培養液から、遠心分離機を用いて菌体を回収し、超音波破砕機によって菌体を破砕した後、遠心分離を行い、その上清を細胞抽出液とした。そして、得られた細胞抽出液のB[a]P分解特性をHPLCなどで調べた。その後、細胞抽出液を用いて、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーを行い、分解酵素の精製を行った。B[a]P分解活性は、B[a]Pの分解代謝物の蛍光波長を測定することで評価した。精製後、得られた酵素の精製度をポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認し、B[a]P分解酵素の分子量、補因子の検討、基質特異性、代謝物の同定などの特性評価を行った。Paenibacillus sp. B2-1株の大量培養後、得られた細胞抽出液とB[a]Pを反応させ、HPLCを用いて分解産物を分析した結果、B[a]Pの分解代謝物であるBenzo[a]pyrene-trans-9,10-dihydrodiolとBenzo[a]pyrene-cis-4,5-dihydrodiolが生成されていることがわかった。さらに、この細胞抽出液を精製した後、得られたB[a]P分解酵素はゲル濾過クロマトグラフィーとSDS-PAGE、Native-PAGEの結果から、サブユニットを構成している酵素であり、その分子量は約440kDaであることがわかった。また、得られた酵素は、NADPHおよびNADHを添加した際、B[a]Pの分解活性が増大し、これらが補因子として働いていることが確認された。さらに、基質特異性の検討を行った結果、B[a]P以外のPAHについても分解活性を確認することができたが、B[a]Pに対してより高い活性を示したことから、B[a]Pに特異性の高い酵素であることが示唆された。

苯并[A] pyrene（B [a] P）是由五个苯环组成的多环形芳烃（PAH），并具有舞者，突变体诱导和内分泌腺体干扰。此外，b [a] p存在于自然环境中，例如土壤期间，但由于其性质而很难被微生物分解。因此，尚未公开报告B [A] P分解微生物的情况，而B [A] P-降解酶及其代谢途径尚未披露。因此，在这项研究中，b [a] p。首先，在只有b [a] p的琼脂培养基上，培养了b2-1的碳酸含量。将通过先前培养的细菌种植在含有0.2 ppm b [a] p的液体培养基中，并在25°C和110 rpm的条件下培养大量培养四天。从这种培养溶液中，使用离心分离剂收集细菌，并将细菌用超声粉碎机粉碎，并分离离心机，并将其用作细胞提取物。然后，通过HPLC检查了获得的细胞提取物B [A] P分解特性。之后，使用细胞提取物，进行IN -ION替代色谱和疏水相互作用色谱，并纯化了降低的酶。通过测量B [a] p的分解代谢产物的荧光长度来评估B [A] P拆卸活性。纯化后，通过聚丙烯酰胺类电子游泳确认所获得的酶的纯化程度，以及B [a] p降解的酶的分子量，成分的检查，底物特异性以及代谢代谢的鉴定是评估。大规模培养后的B2-1，获得的细胞提取物和B [A] P反应，并使用HPLC分析了分解的产物，并且它是B [A] p的分解代谢-9，10-二氢二醇和苯并[A] pyrene-cis-4,5-二氢二醇。此外，在纯化细胞提取物之后，获得的B [A]降解酶是一种基于凝胶过滤色谱，SDS-PAGE和天然页面的结果配置子单位的酶。分子量约为440kDa。当添加获得的酶时，当添加NADPH和NADH时，B [A] P的分解活性增加，并确认它们是发起人的工作。此外，由于检查了底物特异性，还确认了除B [a] P以外的PAH的拆卸活性，但它显示出B [A] P. B [A] P的较高活性，这表明它是高度的特定酶。