原子間力制御型ニアフィールドナノ光学システムを用いたバイオ解析技術の創出

利用原子力控制的近场纳米光学系统创建生物分析技术

基本信息

批准号：
09241213
负责人：
民谷栄一
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Japan Advanced Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09241213/
关键词：
GFP ヒト染色体組み替え大腸菌セントロメアクロマチン

项目摘要

本研究では原子間力制御系を基礎としたニアフィル-ド光学顕微システムと超高感度光計測・解析システムを連結することにより、生体機能の精密解析を行った。今回は、GFP(Green Fluorescent Protein)遺伝子を導入した細胞とヒト染色体を測定材料として選び、これらの立体像(トポグラフィー像)とニアフィル-ド蛍光像の同時精密計測を検討した。本システムを用いて蛍光性タンパク質であるGFPの遺伝子を導入した組み替え大腸菌を測定したところ、大気雰囲気下及び液体培地中双方の条件下において単一の大腸菌細胞から発する近視野蛍光像および蛍光スペクトルをトポグラフィー像と同時に得ることができた。なお、本システムでは、プローブ先端の近接場光を用いた蛍光像であり、励起されている領域はプローブ先端から50-100nmの範囲内と考えられる。すなわち、蛍光像としては細胞表面付近を観察していると考えられる。一方、トポグラフィー像と近視野蛍光像の比較により大腸菌細胞間で蛍光強度のばらつきがあることが明らかになった。これは、GFPの蛍光が翻訳後の酸化により生ずるために生じる酸化の進行度に個体差があるためと考えられた。また蛍光スペクトルは509nm付近にピークを与え、GFPに基づくものであることが示唆された。次に、ヒト培養細胞由来のM期染色体を試料として、核酸を染色する蛍光試薬であるSYBR^<TM>Green I(励起波長490nm、蛍光波長520nm)を用い、立体像と蛍光像を観察することを検討した。ヒト染色体は、培養細胞であるヒト正常リンパ球のRPMI1788株より調製した。培養液中にコルセミド添加後37℃で16時間インキュベートした。コルセミドはコルヒチンと同様に微小管の合成を阻害し細胞周期をM期に固定する生理活性を持つ。この性質を用いて細胞周期を同調させた後、遠心分離によって回収した細胞から界面展開法によって染色体をカバーガラス上に固定、風乾させた。試料の観察は、大気雰囲気下常温常圧で行った。励起光源には波長488nmのAr^+レーザーを用いた。3本の染色体の立体像、その蛍光像を比較した。染色体それぞれの大きさ、セントロメアの位置、表面またはクロマチンの凝集パターンが確認できる。これら形態学的な知見が得られたことは重要で、特に顕著な特徴を示した染色体は、長さ8〜10μm、セントロメアの偏心程度から第4もしくは第5染色体であると考えられた。また染色体全体から蛍光を発しているのが確認され、今回用いたSYBR^<TM>Green Iの染色特性に依存したものと考えられた。

在这项研究中，我们通过连接基于原子力控制系统的近场光学显微镜系统和超高灵敏度光学测量和分析系统，对生物功能进行了精确分析。这次，我们选择了导入了GFP（绿色荧光蛋白）基因的细胞和人类染色体作为测量材料，并研究了其3D图像（形貌图像）和近场荧光图像的同时精确测量。当我们使用该系统测量引入荧光蛋白 GFP 基因的重组大肠杆菌细胞时，我们发现单个大肠杆菌细胞发出的近场荧光图像和荧光光谱在空气和环境中均可测量。在液体介质中可以同时获得形貌图像。在此系统中，荧光图像是使用来自探针尖端的近场光生成的，并且激发区域被认为在距探针尖端 50-100 nm 的范围内。即，认为在细胞表面附近观察到荧光图像。另一方面，形貌图像和近场荧光图像的比较表明，大肠杆菌细胞之间的荧光强度存在差异。这被认为是由于氧化程度存在个体差异，因为 GFP 荧光是由翻译后氧化引起的。此外，荧光光谱在509 nm附近有一个峰值，表明它是基于GFP的。接下来，以源自培养的人体细胞的M期染色体为样本，使用对核酸进行染色的荧光试剂SYBR^<TM>Green I（激发波长490 nm，荧光波长520 nm）进行3D观察和荧光观察。我考虑过。人染色体由培养的人正常淋巴细胞RPMI1788株制备。将秋水仙胺加入到培养液中后，在37℃下培养16小时。秋水仙胺与秋水仙碱一样，具有抑制微管合成、将细胞周期锁定在M期的生理活性。利用这一特性使细胞周期同步后，利用界面发育方法将离心并风干回收的细胞中的染色体固定在盖玻片上。样品的观察是在常温常压、大气中进行的。使用波长为488 nm的Ar^+激光器作为激发光源。比较了三个染色体的三维图像及其荧光图像。可以确认每条染色体的大小、着丝粒位置、表面或染色质聚集模式。这些形态学发现的获得非常重要；根据其长度为8至10μm以及着丝粒的偏心率，认为表现出特别显着特征的染色体是4号或5号染色体。还确认了从整个染色体发出荧光，这被认为依赖于这次使用的SYBR^<TM>Green I的染色特性。