NUMB蛋白質の局在を指標とした脊椎動物の神経発生過程における非対称分裂の研究

以 NUMB 蛋白定位为指标研究脊椎动物神经发生过程中的不对称分裂

基本信息

批准号：
12210029
负责人：
若松義雄
金额：
--
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12210029/
关键词：
神経幹細胞細胞分化 Notch 発生 Numb 非対称分裂神経堤

项目摘要

鳥類胚の中枢神経系の発生過程において、Numbという細胞内因子が分裂中の神経上皮細胞で基底膜側に非対称に局在し、膜受容体であるNOTCH1の細胞内領域と相互作用して、そのニューロン分化抑制活性を抑えることがわかっている。また、神経堤細胞においてもNumbが不等分配される。過剰発現実験の結果などから、Numbを受け取った娘細胞はニューロンに分化し、受け取らなかった娘細胞はNotchの活性化によって未分化状態に留まると考えられる。Numbはアミノ末端側にリン酸化チロシン結合領域、カルボキシ末端側に複数のSH3結合領域様配列を持つ。これらのモチーフを参考に、NumbのcDNAの断片とGFPの融合タンパク質の発現ベクターを構築し、培養細胞でその発現を確認した。まな、中間径フィラメントの一種であるTransitinが神経上皮細胞や神経堤細胞でNumbと酷似した細胞内分布を示すことを見い出した。そこで、培養細胞でNumb断片-GFPとTransitinを同時に発現させたところ、Numbのカルボキシ末端側とTransitinが細胞骨格様の細胞内分布を示した。このことから、NumbとTransitinは複合体を作っており、TransitinがNumbの細胞内局在を制御している可能性が考えられた。神経上皮細胞や神経堤細胞の非対称分裂の際にNumbを受け取った娘細胞と受け取らなかった娘細胞の分化運命を調べるため、倒立型蛍光顕微鏡やCO2インキュベーションチャンバー、CCDカメラを含むタイムラプスシステムを導入した。繊維芽細胞にGFP発現ベクターを導入し、細胞が生きたままの状態でGFP発現細胞を観察し、その細胞系譜を追うことに成功した。このシステムを用いて、Numb-GFPを導入した神経上皮細胞や神経堤細胞の分化運命の解析を開始した。

在禽类胚胎中枢神经系统的发育过程中，一种称为 Numb 的细胞内因子不对称地定位于分裂神经上皮细胞的基底膜侧，并与膜受体 NOTCH1 的细胞内区域相互作用，抑制其神经元分化抑制活性。。麻木在神经嵴细胞中的分布也不均匀。根据过表达实验的结果，接受 Numb 的子细胞分化为神经元，而未接受 Numb 的子细胞由于 Notch 激活而保持未分化。 Numb 在氨基末端有一个磷酸化的酪氨酸结合区，在羧基末端有多个 SH3 结合结构域样序列。以这些基序为参考，我们构建了Numb cDNA片段和GFP之间的融合蛋白的表达载体，并证实了其在培养细胞中的表达。我们发现 Transitin（一种中间丝）在神经上皮细胞和神经嵴细胞中表现出与 Numb 非常相似的细胞内分布。因此，当Numb片段-GFP和Transitin在培养细胞中同时表达时，Numb和Transitin的羧基端侧呈现细胞骨架样细胞内分布。这表明 Numb 和 Transitin 形成复合物，并且 Transitin 可能控制 Numb 的细胞内定位。为了研究在神经上皮细胞和神经嵴细胞的不对称分裂过程中接受 Numb 的子细胞和未接受 Numb 的子细胞的分化命运，我们引入了一个延时系统，其中包括倒置荧光显微镜、CO2 孵育室和 CCD 相机.他们将 GFP 表达载体引入成纤维细胞中，在存活时观察表达 GFP 的细胞，并成功追踪其细胞谱系。使用该系统，我们开始分析 Numb-GFP 转染的神经上皮细胞和神经嵴细胞的分化命运。