神経上皮細胞の分裂におけるTransitin複合体の細胞内局在と分化運命の研究

神经上皮细胞分裂过程中Transitin复合物的亚细胞定位和分化命运研究

基本信息

批准号：
16015214
负责人：
若松義雄
金额：
$ 3.65万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16015214/
关键词：
幹細胞細胞分裂神経発生非対称細胞骨格

项目摘要

脊椎動物の中枢神経系の発生において、Numbは神経幹細胞の分裂時に不等分配されることによって娘細胞の分化運命を制御していると考えられている。これまでに(1)中間径繊維蛋白質であるTransitinがNumbと同様に分裂期神経幹細胞の基底膜側に局在すること(2)TransitinがNumbに直接結合すること、(3)Transitinが基底膜側から側方に移動して不等分配されること等を示した。本年度NumbとTransitinの結合をこれまでFar Western法でなく、免疫沈降法でも確認した。また、エレクトロポレーションによって2本鎖RNAを神経管に導入し、Transitinをノックダウンしたところ、Numbの基底膜側への局在がみられなくなった。このことから、TransitinがNumbの非対称な局在に必須であることが示された。さらに、ヘアピンループ型のRNAを発現するベクターを同様の方法で神経管に導入してTransitinをノックダウンし、ニューロンの分化への影響を調べたところ、分化の促進が観察された。また、アクチン骨格に注目して解析を行い、培養脳スライスを各種薬剤で処理してTransitin-EGFPの動態をタイムラプス観察した。Transitinは細胞表層のアクチン骨格の内側に沿うように分布していたが、サイトカラシンDで処理すると表層アクチン骨格が断片化し、Transitinが細胞表層から外れることがわかった。すなわち、Transitinはアクチン骨格を介して細胞膜に結合していると考えられた。また、Blebbistatinで処理してMyosin2の機能を阻害するとTransitinが側方に移動できなくなった。細胞表層にはMyosin2や活性化型MLCが分布していたことからも、TransitinはMyosinによって表層アクチン上を運ばれていると結論された。

在脊椎动物中枢神经系统的发育过程中，Numb 被认为通过在神经干细胞分裂过程中不均匀分布来控制子细胞的分化命运。到目前为止，我们已经证明：（1）Transitin，一种中间纤维蛋白，定位于像 Numb 这样的有丝分裂神经干细胞的基底膜侧，（2）Transitin 直接与 Numb 结合，（3）Transitin 定位于有丝分裂神经干细胞的基底膜侧。有丝分裂神经干细胞的基底膜侧显示它从一侧移动到另一侧并且分布不均匀。今年，我们不仅通过Far Western方法，而且通过免疫沉淀方法证实了Numb和Transitin的结合。此外，当我们通过电穿孔将双链RNA引入神经管并敲低Transitin时，不再观察到基底膜侧的Numb定位。这表明 Transitin 对于 Numb 的不对称定位至关重要。此外，当使用类似的方法将表达发夹环RNA的载体引入神经管以敲低Transitin，并检查对神经元分化的影响时，观察到分化的促进。我们还重点分析了肌动蛋白骨架，用各种药物处理培养的脑切片，并以延时方式观察 Transitin-EGFP 的动态。 Transitin 沿着细胞表面肌动蛋白骨架的内部分布，但用细胞松弛素 D 处理会破坏表面肌动蛋白骨架，导致 Transitin 从细胞表面脱离。换句话说，转运蛋白被认为通过肌动蛋白骨架与细胞膜结合。此外，当用blebbistatin治疗抑制Myosin2的功能时，转运蛋白不能横向移动。由于肌球蛋白2和活化的MLC分布在细胞表面，因此可以得出结论，转运蛋白是通过肌球蛋白在表面肌动蛋白上转运的。