軽鎖リン酸化による軸糸ダイニンの機能修飾機構の解明

通过轻链磷酸化阐明轴丝动力蛋白的功能修饰机制

基本信息

批准号：
12030203
负责人：
稲葉一男
金额：
$ 1.86万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

軸糸ダイニンの活性調節機構は、精子をはじめ種々の鞭毛繊毛の機能調節に欠くことのできないものである。我々はこれまで、サケ科魚類の精子運動の活性化時にリン酸化される外腕ダイニン軽鎖を同定し、そのcDNAクローニングに成功した。本年度は、この軽鎖のリン酸化に至る周辺経路を明らかにする目的で、軽鎖をリン酸かするプロテインキナーゼ、脱リン酸化するプロテインホスファターゼを中心に研究を進めた。軽鎖はcAMP依存的プロテインキナーゼによりリン酸化されるが、リン酸化部位を含むペプチドを大腸菌で発現したところ、このペプチドは軸糸のcAMP依存的プロテインキナーゼの良い基質となった。一方、この脱リン酸化に関与するホスファターゼを検討したところ、タイプ2Aのプロテインホスファターゼ(PP2A)を同定することができ、オカダ酸感受性の実験からもPP2Aがダイニン軽鎖ホスファターゼであることが明かとなった。一方、軸糸における軽鎖のリン酸化はカルシウムの存在下で著しく阻害される。このカルシウムに依存した脱リン酸化活性(PP2B活性)は軸糸に強く結合しており、オカダ酸による阻害を受けない。PP2Bの軽鎖リン酸化における機能を調べた結果、PP2BはcAMP依存的プロテインキナーゼの調節サブユニットのリン酸化に関与しており、間接的に軽鎖のリン酸化調節に関わっていることが明かとなった。以上、ダイニン軽鎖のリン酸化は複数の酵素による制御を受けており、このような厳密な制御のもと、軸糸運動が制御されていることが明らかになった。

轴向动力蛋白的活性调节机制对于调节包括精子在内的各种鞭毛纤毛的功能至关重要。我们先前已经鉴定出一个外臂动力蛋白轻链，该轻链在激活Salmonidae Fish的精子运动并成功克隆其cDNA时被磷酸化。今年，我们进行了研究，重点是蛋白激酶，这些蛋白激酶磷酸盐和蛋白质磷酸酶磷酸盐磷酸化酶，这些蛋白质磷酸化酶会去磷酸化，以阐明导致该轻链磷酸化的周围途径。轻链被cAMP依赖性蛋白激酶磷酸化，但是当在大肠杆菌中表达含有磷酸化位点的肽时，该肽成为轴向纱的cAMP依赖性蛋白激酶的良好底物。另一方面，当研究了参与该去磷酸化的磷酸酶时，可以鉴定出2A型蛋白磷酸酶（PP2A），而对冈田酸敏感的实验表明PP2A是Dynein轻链磷酸酶。另一方面，在钙存在下，轴向螺纹中光链的磷酸化显着抑制。这种依赖性钙的去磷酸化活性（PP2B活性）与球形螺纹强烈结合，并且不受冈田酸的抑制。 PP2B在轻链磷酸化中的功能表明，PP2B参与了CAMP依赖性蛋白激酶的调节亚基的磷酸化，并间接参与轻链的磷酸化。已经揭示了动力蛋白轻链的磷酸化由多种酶控制，并且轴向线的运动在如此严格的控制下受到控制。