プロテアソームによる精子cAMP依存性プロテインキナーゼの活性調節機構

蛋白酶体对精子 cAMP 依赖性蛋白激酶活性的调节

基本信息

批准号：
10163209
负责人：
稲葉一男
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

サケ科魚類精子の外腕付近にプロテアソームが存在し、精子運動の調節に関与していることはこれまで明らかにしてきた。プロテアソームは何らかの機構で精子鞭毛のcAMP依存性プロテインキナーゼを活性化し、その結果ダイニン軽鎖がリン酸化されると考えられる。本年度は、プロテアソームの基質タンパク質を同定し、いかにしてcAMP依存性プロテインキナーゼの活性調節が行われているのかを明らかにする目的で研究を進めた。まず精子を除膜した後、ホモゲナイズすることにより鞭毛軸糸を単離した。軸糸の高塩濃度溶液による抽出液に、これまで確立した方法で精製した26Sプロテアソームを加えると、60KDaのタンパク質の量がわずかながら減少した。この抽出物をSuperdex200ゲルろ過で分離し、得られた各画分に26Sプロテアソームを加えたところ、60KDを含む画分ではその減少がさらに顕著に観察された。この画分に含まれるタンパク質に対する抗体を作製し、lmmunoblottingを行ったところ、60KDaタンパク質の減少は26S:プロテアソームによる分解が原因で起こることがわかった。このタンパク質が鞭毛のプロテアソーム基質の最有力候補であると考え、現在、精製、cDNAの単離を行っている。一方、プロテアソームの下流にあって、リン酸化によりダイニンの活性調節に関与しているダイニン軽鎖のCDNAクローニングを行なった。その結果、この軽鎖がマウスにおいて受精障害や伝達率歪曲に関与することで知られているtctex2と相同であることがわかった。このタンパク質はいくつかのプロテアソームサブユニットがコードされるマウス第17染色体にコードされるため、プロテアソームのサブユニット遺伝子とダイニンサブユニット遺伝子の連関が示唆された。

到目前为止，已经揭示了蛋白酶体在鲑鱼精子的外臂附近存在，并参与调节精子运动。据认为，蛋白酶体在某种机制中激活了精子鞭毛的cAMP依赖性蛋白激酶，从而导致动力蛋白轻链的磷酸化。今年，我们进行了研究，目的是鉴定蛋白酶体的底物蛋白，并阐明如何调节CAMP依赖性蛋白激酶活性。首先，除去精子，然后均质化以隔离鞭毛纱。当使用先前确定的方法纯化的26S蛋白酶体被添加到由轴纱的高盐溶液制成的提取物中时，在60 kDa时的蛋白质量略有减少。该提取物通过SuperDex200凝胶过滤分离，并将26S蛋白酶体添加到每个分数中，并观察到含60kD的馏分减少。制备针对该馏分中蛋白质的抗体并进行LMMUnoBlotting，并发现60kDa蛋白的降低是由26S：蛋白酶体降解引起的。该蛋白被认为是鞭毛蛋白酶体底物的最可能候选者，目前正在进行纯化和cDNA分离。另一方面，蛋白酶体下游的动力蛋白轻链的cDNA克隆，并参与通过磷酸化来调节动力蛋白活性。结果，发现该轻链与TCTEX2同源，TCTEX2涉及小鼠的受精疾病和传播率失真。该蛋白质编码在小鼠染色体17上，其中几个蛋白酶体亚基被编码，这表明蛋白酶体亚基基因与动力蛋白亚基基因之间有联系。