部位特異的組換えファージ抗体を用いたダイニンの動的構造の解析

使用位点特异性重组噬菌体抗体分析动力蛋白的动态结构

基本信息

批准号：
10175207
负责人：
稲葉一男
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ダイニンは巨大な微小管系のモータータンパク質である。ダイニンはATPを加水分解する際に大きな構造変化を起こすが、この変化はダイニンによる力発生に深く関与すると考えられる。これまでの研究により、ダイニン重鎖における構造変化部位周辺の一次構造を決定した。本年度はこの領域を特異的に認識する抗体を作製し、微小管滑り運動に伴うダイニンの動的構造変化を明らかにすることを目的として研究を進めた。まず、抗体の低分子化と遺伝子組み換えによるエピトープ改変が容易に行える組み換え抗体の作製を試みた。その結果、ダイニンを認識する抗血清およびScFvライブラリーまでは作製することができたが、ファージ粒子上に発現した分子とダイニンとの間の結合が強くなく、ダイニンの研究に有用な抗体は得られなかった。一方、構造変化部位を含む20アミノ酸からなる3種類のペプチドに対するウサギポリクローナル抗体を作製した結果、かなり高い力価の抗体を得ることができた。一つは主要なATP加水分解部位に比較的近いTAV1部位を認識する抗体、及びダイニン重鎖の中央部のTAV4部位に対する抗体、さらに加水分解部位から離れてC末端側に存在するT2部位に対する抗体である。すべての抗体がムラサキウニ精子の外腕ダイニンを特異的に認識し、内腕ダイニンに対する交叉は見られなかった。また、TAV1抗体、TAV4抗体についてはアミノ酸配列から予想されるように、サケやホヤ等、他の動物精子の外腕ダイニンとの交叉性が認められたのに対し、T2抗体はウニ精子ダイニンとのみ反応を示した。ただし、未変性状態のダイニンとはいずれも反応せず、ATPase活性も阻害しなかった。従って、今後はFabフラグメント等の低分子化を検討し、微小管滑り運動の阻害や、構造変化の状態に応じたダイニンのラベリングへの応用の可能性を調べる必要がある。

动力蛋白是巨型微管的运动蛋白。 Dynein在ATP水解过程中引起了重大的结构变化，这种变化被认为与动力蛋白引起的力的发展深深相关。先前的研究确定了动力蛋白重链位点周围的主要结构。今年，我们开发了专门识别该区域并进行研究的抗体，目的是阐明由于微管滑动运动而引起的动力蛋白的动态结构变化。首先，我们试图产生重组抗体，这些抗体可以轻松地减少抗体分子并通过转基因改变表位。结果，识别动力蛋白和SCFV文库的抗血清能够产生，但是在噬菌体颗粒上表达的分子和动力蛋白表达的分子之间的结合并不强，并且未获得对动力蛋白有用的抗体。另一方面，针对由20种含有结构变化位点的氨基酸组成的三种类型的肽制备了兔多克隆抗体，并获得了相当高的滴度。一种是一种抗体，该抗体识别一个相对靠近主要ATP水解位点的TAV1位点，一种抗Dynein重链中部部分TAV4位点的抗体，以及与位于C-末端的T2位点的抗体，远离水解位点。所有抗体都专门识别葡萄海胆精子的外臂动力蛋白，并且没有观察到内臂动力蛋白的交叉。此外，正如TAV1和TAV4抗体的氨基酸序列所预期的那样，在其他动物精子（如鲑鱼和喷水）中与外臂动力蛋白交叉，而T2抗体仅与海胆的超生素染色蛋白反应。然而，动力蛋白都没有与天然状态反应，也没有抑制ATPase活性。因此，将来有必要考虑减少Fab片段和其他分子，并研究根据结构变化的状态抑制微管滑动运动和应用将Dynein标记标记的可能性。