微小管滑り運動に伴うダイニンの構造変化の同定および可視化

与微管滑动运动相关的动力蛋白结构变化的识别和可视化

基本信息

批准号：
09279211
负责人：
稲葉一男
金额：
$ 1.41万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

微小管系モータータンパク質であるダイニンは分子量が約50万と巨大な分子である。近年遺伝子クローニングによりその分子の一次構造が明らかになったが、ATP分解によりどのような構造変化が起こり微小管の滑り運動に結び付くかは依然不明である。本研究ではトリプシンによって切断される部位がATP/Vi存在下、非存在下で異なることを利用して、ATP分解に伴うダイニンの構造変化部位を同定した。その結果、全体として見ればダイニンβ重鎖の4個のP-ループ(ATP結合部位)の近傍が構造変化を受けるが、その範囲は極めて広くβ重鎖の約半分の領域(2077アミノ酸)に及ぶことが明らかになった。またP1-loopの近くに存在する構造変化部位(TAV1 site)からC末端側の領域でクラミドモナス軸糸ダイニンや細胞質ダイニンと90%以上のidentityを有する高度に保存された領域が存在することも明らかになった。さらに、他のTAV領域については領域によってダイニン一般に高く保存されている領域、軸糸ダイニンのみで保存されている領域、保存性は特に高くない領域等が存在することがわかり、個々のダイニン固有の機能を反映しているものと思われる。実際の微小管滑り運動時にみられるダイニンのATP加水分解に伴う構造変化を可視化することを目的として、各TAV部位近傍の約20アミノ酸配列に対するペプチド抗体を作製したが、これらはすべてダイニンヘの結合性、ATPase阻害能、鞭毛運動阻害能を欠いていた。lgGよりもさらに低分子化されており、また遺伝子操作によりさまざまな分子改変が可能な組換えファージ抗体の作製を現在試みている。

Dynein是一种微管运动蛋白，是一个巨大的分子，分子量约为500,000。近年来，基因克隆揭示了该分子的主要结构，但是由于ATP降解导致了什么样的结构变化，导致微管的滑动运动。在这项研究中，我们使用了在ATP/VI的存在下通过胰蛋白酶裂解的位点的差异，并确定了与ATP降解相关的Dynein结构变化的位点。总体而言，据揭示了构象变化发生在动力蛋白β重链的四个P环（ATP结合位点）附近，但范围非常宽，覆盖了大约一半（2077个氨基酸）的β重链的一半。还可以揭示出一个高度保守的区域，该区域位于结构变化位点的C末端区域（TAV1位点），位于P1环附近的C末端区域，并且具有90％或以上的身份。此外，很明显，其他TAV区域通常在动力蛋白中高度保守的区域，仅与动力蛋白保守的区域，并且不是特别保守并且不是特别保守的区域，并且认为这反映了每种动力蛋白的独特功能。为了想象在实际微管滑动运动过程中与动力蛋白的ATP水解相关的结构变化，对每个TAV位点附近的大约20个氨基酸序列制备了肽抗体，所有这些位点附近的氨基酸序列都缺乏Dynein，ATPase抑制和Flagella运动抑制的结合特性。我们目前正在尝试生产重组噬菌体抗体甚至比LGG小，并且可以通过基因工程在各种分子中进行修饰。