無細胞インフルエンザウイルス粒子形成系の確立

无细胞流感病毒颗粒形成体系的建立

基本信息

批准号：
11877052
负责人：
永田恭介
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、感染性を持ったインフルエンザウイルス粒子の無細胞形成系を確立し、粒子形成機構を明らかにするために行った。まずマーカーRNAゲノムを作製するために、マーカーとなるペプチドとしてHIVのV3領域を選択し、これを指令する配列をインフルエンザウイルスNAのストーク部分を指令する領域に組み込んだ組換えRNAを作製した。すでに我々が開発している感染性RNP複合体の再構成系を用いて細胞に導入したところ、組換えRNAグノムを持ったウイルス粒子が回収された。この組換えウイルスは再感染を繰り返しても安定に保持されており、組換えRNAは再構成ウイルス粒子形成の検定に使用可能と考えられた。ついで、組換えM1を調製して、粒子内部から調製したものと同等と考えられるM1-RNP複合体を再構成した。M1の複合体形成に関与する領域は、M1のRNA結合ドメインであるM1の91〜110アミノ酸からなる領域と判明した。エンベロープの材料として感染細胞から調製した膜画分は、M1との結合性を示した。M1の欠失変異体を用いた解析から、M1の膜への結合には、RNA結合にかかわるドメイン以外の全体の構造保持が重要であることが示唆された。以上で、試験管内でのRNP-M1複合体のエンベロープ材料による被覆を行うための基盤はととのった。本研究では、さらに分節ゲノムの集合機構に関わる解析を開始した。試験管内系を用いたゲノムRNAの核外輸送機構を解析している途中で、核から排出されたゲノムRNA分節がすでに集合している可能性に気づいた。このことにおいて、科研費の本研究としては十分な成果がでた。

进行了这项研究以建立用于感染流感病毒颗粒的细胞形成系统，并阐明颗粒形成机制。首先，为了创建标记RNA基因组，选择了HIV的V3区域作为标记肽，并制备了重组RNA，其中将其命令的序列纳入了构成流感病毒病毒的Stoke部分的区域。当我们使用已经开发的感染性RNP复合物的重建系统引入细胞时，回收了带有重组RNA ganmes的病毒颗粒。即使在重复再感染后，这种重组病毒仍保持稳定，并且人们认为重组RNA可用于测定形成重构病毒颗粒的形成。然后准备重组M1重建M1-RNP复合物，该复合物被认为与颗粒内部制备的复合物相当。发现与M1复合物形成相关的区域是由M1的91-110氨基酸（M1的RNA结合结构域）组成的区域。由感染细胞制备的膜馏分作为包膜的材料显示与M1结合。使用M1缺失突变体的分析表明，除了参与RNA结合的结构域外，总体结构保留对于M1与膜的结合很重要。因此，已经设置了将RNP-M1复合材料与试管中的包膜材料涂覆的基础。在这项研究中，我们还开始分析与节段基因组的组装机理有关的分析。在使用体外系统分析基因组RNA的核输出机制时，我意识到可能已经收集了从细胞核排出的基因组RNA片段。在这方面，在科学技术研究基金下，这项研究取得了足够的结果。