酵母を用いたインフルエンザウイルスゲノム複製・転写系の確立と宿主因子の探索

利用酵母建立流感病毒基因组复制/转录系统并寻找宿主因子

基本信息

批准号：
17659133
负责人：
永田恭介
金额：
$ 2.11万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、動物細胞を宿主とするインフルエンザウイルスのゲノムの複製とウイルス遺伝子の転写を酵母細胞の中で行わせる系を確立し、ついで遺伝学的な手法を用いてこれらの過程に関与する宿主因子を同定しようというものである。酵母では全ゲノム配列が決定されており、ウイルスRNA合成に関連した変異体の相補試験で因子を簡便に同定できる。相同性を基盤に、同定された因子の動物細胞オルソログの機能解析を行なう。精製ウイルス粒子より調製したvRNP(ウイルスゲノム-タンパク質複合体)を培養細胞に導入することにより、ウイルスゲノムの複製・転写が起きる。我々は酵母でも同様に導入されたv即Pからウイルスゲノムの複製・転写が起きることを見いだした。ウイルスRNA合成を促進する既知の宿主因子RAF-2p48の酵母ホモログであるSUB2の欠損酵母では、vRNPからのウイルスRNA合成量が低下していた。すなわち、酵母内ウイルスゲノム複製・転写系で宿主因子の探索および機能解析が可能であると考えられた。そこで、Yeast single-gene deletion libraryを用いてそれぞれの遺伝子欠損酵母に個別にvRNPをトランスフェクションし、ウイルスRNA合成活性に影響を及ぼす酵母遺伝子の探索を行なった。その結果、スプライシング関連因子の複数の欠損株においてウイルスRNA合成活性の低下が観察された。その中で最もRNA合成活性に影響を与える因子であったCUS2に注目し詳細な解析を行なった。CUS2のヒトホモログはTat-SF1であり、Tat-SF1ノックダウン細胞でウイルスRNA合成量の低下が観察された。さらにTat-SF1の過剰発現細胞株ではウイルスRNA合成活性が促進されていたことから、Tat-SF1がウイルスゲノムの複製・転写に促進的に機能する宿主因子であることが示唆された。本研究により、酵母内ウイルスゲノム複製・転写系が確立され、網羅的な宿主因子スクリーニングが可能となり、さらにウイルスゲノム複製・転写メカニズムの解明が大きく進展するもの期待される。

这项研究的目的是建立一个系统，在该系统中，由动物细胞托管的流感病毒的基因组，并在酵母细胞中进行病毒基因的转录，然后使用遗传技术鉴定涉及这些过程中涉及的宿主因素。整个基因组序列是在酵母中确定的，并且在与病毒RNA合成相关的突变体的互补测试中很容易鉴定。基于同源性，对已确定因素的动物细胞直系同源物进行功能分析。从纯化的病毒颗粒制备的VRNP（病毒基因组蛋白质复合物）被引入培养细胞中，并发生病毒基因组复制和转录。我们还发现，病毒基因组的复制和转录是从引入的V-P中以相同的方式发生的。在Sub2缺乏的酵母中，促进病毒RNA合成的已知宿主因子RAF-2P48的酵母同源物降低了VRNP的病毒RNA合成量。换句话说，人们认为可以使用酵母内病毒基因组复制和转录系统在功能上进行搜索并在功能上进行分析。因此，使用酵母单基因缺失文库将每个基因缺陷酵母单独转染，并搜索影响病毒RNA合成活性的酵母基因。结果，在与剪接相关因素的多种缺陷菌株中观察到了病毒RNA合成活性的降低。我们专注于CUS2，这是最大程度地影响RNA合成活性的因素，并进行了详细的分析。 CUS2的人类同源物是TAT-SF1，在Tat-SF1敲低细胞中观察到病毒RNA合成的降低。此外，在TAT-SF1的过表达细胞系中促进了病毒RNA合成活性，这表明TAT-SF1是促进病毒基因组复制和转录的宿主因子。预计这项研究将在酵母病毒基因组中建立复制和转录系统，从而允许对宿主因子进行全面筛查，此外，阐明复制和转录机制是一个重大改进。