单克隆抗体药物核磁共振信号指认以及核磁技术在单抗高级结构上的应用研究

The higher order structure (HOS) is one of the critical quality attributes (CQA) of therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) because it is related to the safety, efficacy and pharmacokinetic properties of mAbs. As one of the major techniques in structural biology, nuclear magnetic resonance (NMR) offers unique advantage of high resolution to study HOS of proteins. However, its application on mAbs is mitigated by the difficulty in NMR resonance assignment as the isotopically labeled mAbs are not always available. Here we propose an unique NMR assignment strategy for mAbs using the natural-abundance samples. The strategy involves selective modification of the target amino acid and quantification of the modification rate by both NMR and MS. The NMR assignment of target amino acid is made by correlating the quantitative results obtained from both NMR and MS. Eventually we will establish an NMR platform to study the HOS of mAbs with site-specific information. The feasibility of this proposal has been demonstrated on tnatural-abundance proteins such as hen egg white lysozyme and porcine pepsin. We believe the success of this program will open a new avenue to structural characterization and quality control of therapeutic mAbs and other biotherapeutic molecules.

单克隆抗体药物的高级结构与其安全性和有效性密切相关，是单抗类药物的关键质量属性。高场液相核磁共振波谱技术作为蛋白质精细高级结构的主要表征手段，目前在单抗类药物上的应用却十分有限，其中一个重要原因是单克隆抗体的核磁共振波谱信号指认难以获得。针对这个问题，本项目拟开发一种借助质谱技术的新方法对单抗的核磁共振波谱信号进行指认的方法，并且在此基础上进一步开发利用核磁共振对单克隆抗体药物高级结构表征以及质控的方法。目前我们已成功地对自然丰度的蛋清溶菌酶和胃蛋白酶的部分核磁共振波谱信号进行了指认，验证了该方法的可行性。本项目的成功实施将有效提高液相核磁共振波谱技术在单克隆抗体药物及其他蛋白质药物中的应用。

单克隆抗体药物的高级结构与其安全性和有效性密切相关，是单抗类药物的关键质量属性。针对目前核磁共振（NMR）技术在单抗药物高级结构表征上应用的瓶颈，即自然丰度下蛋白质NMR信号的指认问题，申请人在本项目基金资助下，开发了一个全新的借助LC-MS 对于自然丰度的蛋白质侧链NMR 信号指认的新方法，并创新地利用氨基酸专属性化学修饰对于NMR 信号进行指认；在方法建立的基础上，进一步探索MS 和NMR 技术相结合的方法在降钙素基因相关肽（CGRP）抗体药物抗原表位研究中的应用。此外，我们以贝伐珠单抗、地诺单抗、纳武利尤单抗、阿柏西普等生物药为例，建立了基于MRM羟自由基足迹法表征单抗高级结构的新方法；提出基于MRM、TRFIA（时间分辨荧光免疫）技术的药代动力学研究新思路；以及开展应用报告基因法和基于ECL（电化学发光）的 ELISA法分别检测生物活性和免疫原性等方面的研究工作。本项目的实施可为其他不易同位素标记的蛋白质的NMR信号指认提供有意义的参考，进一步推动MS和NMR技术在蛋白质高级结构和蛋白质间相互作用的应用，本研究中建立的表征和药代等方法也可为生物药开发筛选、药物安全性评价等提供新的思路。

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