カンファー水酸化酵素P450と鉄イオウたんぱく質の複合体:複合体形成によって誘導されるP450の活性型構造と誘導機構の解明

樟脑羟化酶P450与铁硫蛋白的复合物：阐明复合物形成诱导的P450的活性结构和诱导机制

基本信息

批准号：
11169236
负责人：
島田秀夫
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

P450camの活性型構造における分子状酸素の開裂機構を検討するため活性部位アミノ酸残基Thr252をIleに置換し、構造と機能の関連を検討した。本変異酵素のカンファー水酸化活性は野生型のほぼ1/10に低下した。そこで酵素反応サイクルの各部分反応の反応速度論的解析の結果、還元型酵素、基質カンファーそして酸素の3者複合体である酸素化型反応中間体が還元型プチダレドキシン(Pdx)によって還元され、酸化型酵素、水酸化カンファーならびに水を生成する反応の速度が野生型の1/30に低下したことが明らかになった。しかし酸化型中間体が還元型Pdxに還元される過程を含めて、その他の部分反応は変異によって殆ど変化しなかった。還元型Pdxによる酸素化型中間体の還元反応は、酸化型酵素の還元反応とは異なりプロトン供給と強く共役している。したがって前者の反応のみが遅くなったとの結果は、還元反応に共役したプロトン供給が変異によって遅くなったことを示唆する。そこで本酵素の結晶構造と、一方プロトン供給反応が速いことが知られている野生型とThrをAlaに置換した変異酵素の結晶構造を比較検討した結果、活性部位の水酸基と水分子があるいはその両者がプロトンの速やかな供給に必要な因子と推定された。またIle変異酵素ではプロトン供給が酸素分子の開裂に共役する効率は、Ala変異酵素の約10倍に上昇したが野生型の1/2であった。この結果はAla変異酵素のように水酸基が存在しない場合の水分子は、プロトン供給を妨げないが、分子状酸素の開裂反応を妨げる作用をもつことを示唆する。またP450反応においては分子状酸素が2電子還元されたペルオキシド型酸素が解裂する。この開裂機構を検討するためP450とは活性部位構造を異にするミオグロビン(Mb)を用いてペルオキシド酸素(過酸化水素)との反応を速度論的に解析し、開裂機構の全貌を初めて明らかにすることに成功した。

为了研究P450CAM活性结构中分子氧裂解的机理，活性位点氨基酸残基THR252被ILE取代，并研究了结构和功能之间的关系。该突变酶的樟脑羟基活性降低至野生型的近1/10。因此，对酶反应周期中每个部分反应的动力学分析表明，氧化反应中间体是一个三部分的酶的复合物，由酶降低酶（PDX）降低，降低酶（PDX），以及产生氧化剂的氧化氧化物的速率和氧化物的氧气速率，氧化氢和氧气的速率降低。但是，其他部分反应几乎不会因突变而改变，包括将氧化中间体降低至降低的PDX的过程。与氧化酶的还原反应不同，含氧化中间体与还原PDX的还原反应与质子供应有很强的缀合。因此，只有前反应放慢的结果表明，突变与还原反应相结合的质子供应会减慢。因此，我们将该酶的晶体结构与野生型的晶体结构进行了比较，野生型的晶体结构已知具有快速的质子供应反应，而突变酶则被THR替换为ALA，并且估计有活性位点中的羟基和水分子是快速质子供应的因素。此外，将质子供应与Ile突变酶裂解的质子供应的效率增加了约10倍的ALA突变酶，但野生型为1/2。该结果表明，在没有羟基（例如ALA突变酶中的水分子）中，水分子不会干扰质子供应，而是可以防止分子氧的切割反应。此外，在P450反应中，过氧化物型氧，已通过两个分子氧的电子降低。为了研究这种切割机制，使用肌红蛋白（MB）对过氧化氧（MB）的反应进行了分析，该反应与P450具有不同的活性位点结构，并成功地发现了首次裂解机制的全部程度。