無細胞たんぱく合成系でのチトクロム酸化酵素の機能発現: 人工アミノ酸の部位特異的導入法を利用したプロトン能動輸送機構の解析を目指して

无细胞蛋白质合成系统中细胞色素氧化酶的功能表达：旨在通过位点特异性引入人工氨基酸来分析质子主动转运机制

基本信息

批准号：
09878148
负责人：
島田秀夫
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

シトクロム酸化酵素のプロトン輸送機構を解明するため、その解析方法として安定同位体ラベルのアミノ酸を部位特異的に導入し、酸素の還元反応にともなうアミノ酸残基の変化を振動分光法で直接観察することを計画した。この導入は無細胞たんぱく合成系を使用するため、本研究では、酵素の機能発現システムの構築を以下のように試みた。Paracoccus denitrificansのシトクロム酸化酵素のサブユニットIβ、II、III遺伝子をPCR法でクローニングし、それぞれの塩基配列を確認後、プラスミドpUC18のlacプロモーターの下流にIβ、II、IIIの順に挿入し発現ベクターを構築した。なおIβのC末端にHis-Tagを挿入した。このベクターを用い、大腸菌内で本酵素の発現を試み、発現の有無をWestern blot法で解析した。Blot解析に用いた抗体は、精製酵素標品(姫路工大、吉川教授より分与された)をウサギに接種して得た。今回用いた精製標品はIβ、IIのみを含む。従って得られた抗体はIβ、IIに対するものなので、この方法ではIIIは検出されない。大腸菌の膜画分から、dodecylmaltosideで可溶化された分画を、Ni-NTAカラムを用いて部分精製し、Blot法で部分精製標品が、Iβ、IIたんぱくを含むことを確認した。次に大腸菌の無細胞たんぱく合成系を用い、^<35>S-methionineの取り込みで発現を検討したところ、Iβ、II、IIIに一致するサイズのたんぱくがベクターに依存して検出された。従って無細胞系での発現が示された。またラット膵臓の膜画分あるいはphosphatidylcholineからなるリポソームを添加し発現量が5倍に上昇することを見出した。発現量はほぼ充分なので、今後はヘムを外部から加え、リポソームへの機能発現を試みる。以上の成果は、本年度の日本生物物理学会で発表した。

为了阐明细胞色素氧化酶的质子转运机制，我们计划特定地将标记为氨基酸的稳定同位素作为一种分析方法，直接观察到与振动镜头减少氧气反应相关的氨基酸残基的变化。由于此引言使用了无细胞蛋白质合成系统，因此在本研究中，我们试图为酶构建功能表达系统，如下所示。通过PCR克隆了来自danitrificans的细胞色素氧化酶的亚基Iβ，II和III，并确认了每个的碱基序列，并以Iβ，II和III的顺序构建了表达载体，并以Iβ，II和III的顺序构建了质体PUC18的lac启动子的下游。此外，将HIS标签插入了Iβ的C端。使用该载体，试图将酶在大肠杆菌中表达，并通过蛋白质印迹法分析表达的存在或不存在。通过用纯化的酶制剂接种兔子（由Himeji Technology Yoshikawa教授分配），获得了用于印迹分析的抗体。这次使用的纯化制剂仅包含Iβ和II。因此，由于所产生的抗体是针对Iβ和II的，因此未通过该方法检测到III。使用Ni-NTA柱部分纯化了从大肠杆菌的膜分数上溶解在十二烷基马尔替剂上的馏分，并通过含有蛋白质Iβ和II的印迹方法确认了部分纯化的制剂。接下来，使用大肠杆菌的无细胞蛋白质合成系统，通过摄取 ^<35> s-甲硫代的摄取研究表达，并以载体依赖性方式检测到与Iβ，II和III一致的蛋白。因此，证明了无细胞系统中的表达。此外，发现添加由大鼠胰腺或磷脂酰胆碱的膜级分成的脂质体，以将表达水平提高5倍。表达水平几乎足够，因此将来，血红素将在外部添加，以尝试将功能表达到脂质体中。上述结果今年在日本的生物物理学会上提出。