変異体の機能と構造との解析によるチトクロム酸化酵素のプロトンポンプ機構の研究

通过分析突变体的功能和结构研究细胞色素氧化酶的质子泵机制

基本信息

批准号：
18054030
负责人：
島田秀夫
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

チトクロム酸化酵素は分子状酸素を還元し水にするとともにプロトン(H^+)を膜内側から外側に能動輸送 (ポンプ)する膜蛋白質複合体である。ウシ酵素のX線構造と変異体解析により我々はH-pathwayがH^+ポンプ経路であると提唱している。この経路は、水素結合ネットワークと、これと膜内側分子表面とを連結する水経路とから構成される。この水素結合ネットワークは、補欠分子であるヘムaの側鎖ホルミル基およびプロピオン酸基と水素結合をする。したがって、H^+まヘムaにより駆動されることが示唆される。今回このヘムa側鎖プロピオン酸基の役割を検証するモデル実験を実施した。ヘムbの側鎖プロピオン酸基(6,7位)が、それぞれメチル基に置換されたヘムを合成した。再構成法により6位欠損ヘムをチトクロムP450camに導入し、その機能を検討するとともにX線構造を決定した。構造変化は最小限であり、機能への影響も顕著でなかった(JACS,130,432,2008)。これまで、この側鎖は、ヘムの安定化に重要であるとともに、電子供与体からヘム鉄への電子伝達経路を形成すると提唱されていたが、上記結果は、これらを支持しなかった。側鎖欠損ヘムを利用した側鎖機能の検証が可能である。H^+ポンプの経路と機構との研究には、H^+ポンプ過程での機能中心アミノ酸側鎖官能基の化学構造および立体構造変化を赤外分光法で捕捉することが必要である。しかし、赤外スペクトルの検出と帰属のためには、無細胞系で蛋白合成をし、機能中心アミノ酸の部位特異的安定同位体標識化が不可欠である。細菌のチトクロム酸化酵素を大腸菌の無細胞系で機能発現する研究を10年続け、本年チトクロムc酸化活性と吸収スペクトルが正常である酵素標品を得る系を確立した。この無細胞発現系では、アミノ酸残基の標識化に加え、人工ヘムの導入も可能であり、構造に基づいた反応機構研究に有効である。

细胞色素氧化酶是膜蛋白络合物，可将分子氧降低到水中，并从膜内部到外部从膜内到外部运输（泵）质子（H^+）。牛酶的X射线结构和突变分析表明H-Pathway是H^+泵途径。该途径由氢键网络和将其连接到内膜分子表面的水路组成。该氢键网络是氢键与假体分子血红素a的侧链甲基和丙酸基团的结合。因此，建议它由H^+ Heme a驱动。这次，我们进行了一个模型实验，以验证该血红素侧链丙酸酯组的作用。合成了血红素B侧链丙酸基团（位置6和7）的血液被合成。通过重建将6位缺陷血红素引入细胞色素P450CAM中，并研究了其功能并确定X射线结构。结构变化是最小的，功能效应并不显着（JACS，130，432，2008）。到目前为止，已经提出该侧链对于血红素稳定很重要，并形成了从电子供体到血红素铁的电子传输路径，但是上述结果不支持这些。可以使用侧链缺陷血红素来验证侧链功能。研究H^+泵的途径和机制需要红外光谱，以捕获H^+泵工艺过程中功能中心氨基酸侧链官能团的化学结构和构象变化。然而，为了检测和分配红外光谱，蛋白质合成在无细胞系统中至关重要，功能中心氨基酸的位点特异性同位素标记至关重要。我们继续研究细菌细胞色素氧化酶在大肠杆菌无细胞系统中的功能10年，今年我们已经建立了一个系统，以获得具有正常细胞色素C氧化活性和吸收光谱的酶制剂。在这个无细胞表达系统中，除了标记氨基酸残基外，还可以引入人造血红素，从而有效地对基于结构的反应机理研究有效。