チトクロ-ムP450camにおける酸素ポケットの構造と機能の相関の解明ーアミノ酸置換による機能変換の解析ー

阐明细胞色素P450cam中氧袋的结构与功能之间的关系 - 通过氨基酸取代进行功能转换的分析 -

基本信息

批准号：
02680224
负责人：
島田秀夫
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至 1991
项目状态：
已结题

项目摘要

チトクロ-ムP450(Pー450)は、プロトヘムIXをもち、その一酸化炭素化型のソ-レ-帯を450nm付近に有する一原子酸素添加酵素の総称である。この酵素の触媒作用により分子状酸素の一原子は水に還元され残り一原子は基質である有機化合物に添加(水酸化)される。この時二電子と二個のプロトンが必要である。細菌のカンフア-水酸化酵素であるP450camの活性部位には、そこに結合した分子状酸素を囲む形の構造(酸素ポケット)が存在する。ポケットを構成するアミノ酸の配列が各P450間でよく保存されていること、結晶構造が明らかにされている他のヘムタンパクにはこのような構造は認められないことから、これはP450の機能と関わる構造と推定されている。本研究はP450camの触媒作用と酸素ポケットの相関を明らかにすることを目的とする。そこでポケットを構成するアミノ酸(GlyーGlyーValー251Aspー252ThrーVal)の置換を行い、既に(1)252ThrのーOH基が水酸化反応(OーO結合の切断反応)に必須であること。(2)251Aspは酸素化型反応中間体に電子が効率よく渡るのに必須であること等を明らかにした。本年度は、以上の結果をさらに発展させ、酸素の触媒作用に必要なプロトンの供与機構に関する新しい知見等を得た。天然型Pー450camの酸化還元電位を広いpH範囲(pH5.6ー9.0)で測定し、酸性解離基(pKa=6)が還元型酵素のヘム周辺に存在することが示唆された。またこの解離基の存在は、一酸化炭素化型のCーO伸縮振動の測定からも裏づけられた。上述した251Aspまたは252Thrを改変した酵素では、電位、伸縮振動に有意なpH依存性が見られず、この2つのアミノ酸残基が解離性基の発現に関与しているものと推定された。結晶構造を見ると252Thrはヘム鉄と相互作用できる位置にあるが、251Aspはそのような位置にない。従ってAspとThrの間に水分子を介したcharge relay系が存在しAsp残基の解離がThrのーOH基の状態を変化させると考えれば上述の結果を説明できる。一方X線構造解析を検討すると、上述した酸性の解離基を説明するcharge relay系の一つとして、252Thrから3分子の水を介して366Gluに到るsolvent channelが考えられる。そこで366GluをMetに変異されたが、この変異酵素には天然型と同じ酸性解離基が観察され、カンファ-水酸化活性も高い。従ってこの系が上述したcharge relay系とは考え難い。以上の結果251Aspから252Thrに到るcharege relay系の存在が示唆され、最終的にThrのーOH基が、OーO結合切断に必要なプロトンの供与すると考えられる。そこでこの基と配位子との相互作用の有無を検討した。重水中、一酸化炭素型P450camのCーO伸縮振動を検討したところ、252Thrの時のみ重水の効果が観察され、252変異酵素では効果は殆ど観察されなかった。このことからThrのーOH基と結合CO間の相互作用(水素結合)が示唆された。

细胞色素P450（P-450）是具有原子质IX的单原子氧酶的一般项，其碳一氧化碳型鞋底带约为450 nm。通过催化该酶，将一个分子氧的原子还原为水，并将其余原子（羟基化）添加到有机化合物（即底物）中。目前，需要两个电子和两个质子。细菌性功夫 - 羟化酶P450CAM的活性位点具有围绕其分子氧结合的结构（氧气袋）。由于构成口袋的氨基酸的序列在每个P450之间是充分保守的，并且在揭示了晶体结构的其他血红素蛋白中未发现这种结构，因此假定这是与P450功能有关的结构。这项研究旨在阐明P450CAM和氧气袋的催化之间的相关性。因此，已经替换了构成口袋的氨基酸（Gly-Gly-val-251ASP-252THR-VAL），并且（1）252THR的OH组对于羟基化反应（O-O键的裂解反应）已经至关重要。（2）已经澄清的是，251ASP对于有效的电子转移至氧化反应中间体至关重要。今年，我们进一步开发了上述结果，并获得了有关捐赠氧气所必需的质子机制的新知识。天然P-450CAM的氧化还原电势是在较大的pH范围内（pH 5.6-9.0）测量的，这表明在还原酶的血红素周围存在酸性解离组（PKA = 6）。通过测量一氧化碳型CO拉伸振动的测量，该解离组的存在也得到了支持。从上述251ASP或252THR中修饰的酶在电位或拉伸振荡中没有明显的pH依赖性，据估计，这两个氨基酸残基参与了可分离基团的表达。从晶体结构中看，252THR处于可以与血红素铁相互作用的位置，但是251ASP不在该位置。因此，如果我们认为通过ASP和THR之间的水分子有一个电荷继电器系统，并且ASP残基的解离会改变THR-OH基团的状态。另一方面，在检查X射线结构分析时，上述酸性解离组的电荷继电器系统之一是一个溶液通道，该通道从252THR到366GLU，从252THR到三个水分子。因此，将366Glu突变为MET，并且在该突变酶中观察到与自然形式相同的酸性解离组，并且它也具有较高的樟脑羟基化活性。因此，很难想象该系统是上面提到的电荷继电器系统。以上结果表明，存在从251ASP延伸到252THR的电荷继电器系统的存在，并且据信THR的-OH基团最终将贡献O -O键裂解所需的质子。因此，我们研究了该组是否与配体相互作用。当在重水中检查一氧化碳型P450CAM的CO拉伸振动时，仅在252THR时观察到重水的作用，而对于252个突变酶，几乎没有效果。这表明THR-OH组与键Co之间的相互作用（氢键）。