高電界によるDNAの分子ビーム化の検討

利用高电场形成DNA分子束的思考

基本信息

批准号：
10875017
负责人：
水野彰
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Toyohashi University of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10875017/
关键词：
DNA 分子ビーム伸長固定ゲノム解析

项目摘要

DNA1分子を真空中に取り出し伸ばした状態で針状に固定し、高電圧を印加することにより電界の集中するDNA分子の先端から化学結合を順次切断され、分子ビームが発生することが期待される。その分子ビームを直接、質量分析装置等で解析することが可能になれば、従来の生化学的手法を用いることなく簡便でかつ直接的な塩基配列決定が実現できると思われる。この手法を実現するためにはDNA1分子を伸長固定する技術の開発が求められている。そこで、微細加工した金属針の先端にポリエチレングリコールと低分子カチオンでグロビュール構造を誘導したDNA分子を誘電泳動力により吸着させた後に脱グロビュール化させるためのバッファー交換を行ない、スライドガラス上にDNAを末端から順に伸長固定する方法を開発した。この技術を用いることで、ガラスキャピラリー先端にDNA1分子を伸長し、それを凍結昇華することで分子ビームを作るための基質を製作することができると考えられる。しかし、現状ではヌクレオチド1分子レベルでの検出は極めて困難である。そこで、分子ビームの検出の予備実験として繊維状のDNAを高電圧側の電極に固定し、TBEバッファで満たしたマイクロチューブ内部に接地電極を置き、DNAに立ち上がり時間の速い高電圧パルスを印加することによりチューブ内に切断されたDNA分子を回収することを試みた。しかし、これらの実験を空気中で行った結果、DNA分子が酸化してしまったため、酸化を防ぐためにアルゴンに置換して実験を行った。アルゴン雰囲気中で高電圧を印加して得られた試料の吸光度を測定した結果、260nmの吸光度としては0.18程度が得られた。その際の280nmの吸光度との比を調べた結果、試料中に切断されたDNAが回収されていると考えられる。これらの結果からDNA1分子を基質とした分子ビームの作製が可能であると期待される。

将单个DNA分子放入真空中，将其拉伸并固定为针状，然后施加高电压，从电场集中的DNA分子尖端依次切断化学键，产生分子束预计会产生。如果可以使用质谱仪等直接分析分子束，则可以在不使用常规生化方法的情况下容易且直接确定碱基序列。为了实现这一方法，需要开发一种拉伸并固定单个DNA分子的技术。因此，我们利用介电泳力将用聚乙二醇和低分子量阳离子诱导形成球状结构的DNA分子吸附到微型金属针的尖端上，然后交换缓冲液以将DNA分子去球化到载玻片上。我们开发了一种从末端开始按顺序拉长和固定的方法。通过使用这项技术，人们认为可以将单个 DNA 分子延伸到玻璃毛细管的尖端，并将其冷冻和升华，以创建用于产生分子束的基底。然而，目前在单个核苷酸分子水平上进行检测极其困难。因此，作为分子束检测的初步实验，我们将纤维状DNA固定在高压电极上，将接地电极放置在充满TBE缓冲液的微管内，并向DNA施加快速上升时间的高压脉冲。我们试图通过这样做来回收管内被切割的 DNA 分子。然而，由于在空气中进行这些实验，DNA分子被氧化，因此为了防止氧化，气氛被氩气置换。对在氩气氛下施加高电压的样品测定吸光度，结果260nm处的吸光度约为0.18。检查与280nm处的吸光度之比的结果，认为在样品中回收了切割的DNA。根据这些结果，预计将有可能使用单个 DNA 分子作为基底来产生分子束。