DNA複製反応の1分子蛍光観察と形態制御技術の開発

DNA复制反应单分子荧光观察及形态控制技术的发展

基本信息

批准号：
18048025
负责人：
水野彰
金额：
$ 7.62万
依托单位：
Toyohashi University of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は生化学反応が起きているその場で、しかもリアルタイムで観察できる1分子観察・1分子計測技術をDNA複製反応の解析に適用することを目的とした。18年度までにDNA合成反応の可視化で必要となる1本鎖DNAを蛍光顕微鏡視野内で調製することに成功し、DNA消化酵素exonucleaseIIIが1分子のDNAを消化していく様子を直接観察している。ここで興味深いことに、exonucleaseIIIはDNAを伸張させた状態と弛緩させた状態では消化速度が異なることが示された。そこで本年度は1分子計測に基づくDNA-タンパク質間相互作用の解析ではDNA1分子の形態を制御させながら反応を解析できる点に着目し、DNAの形態とDNA消化反応の関係について実験的に明らかにすることを試みた。その結果、DNAを伸張させた場合には弛緩させた場合と比較してDNA消化速度が2倍以上速くなることが示された。DNAの形態と酵素反応の関係は非常に興味深く、1分子観察技術の利点を生かした研究であるといえる。加えてDNA-タンパク質間相互作用におけるタンパク質の詳細な挙動解析を目的としたタンパク質の蛍光標識法について検討し、DNA-タンパク質間相互作用を阻害しない蛍光標識方法を示した。その例としてDNA複製時に1本鎖DNA (ssDNA)と結合するReplication Protein A (RPA)の蛍光標識を行い、さらにssDNA-RPA複合体の1分子蛍光観察に成功した。以上の結果は、DNA複製反応をはじめとする各種DNA-タンパク質間相互作用への適用が期待され、詳細な挙動の解明に貢献できると考えられる。

本研究的目的是将单分子观察和单分子测量技术应用到DNA复制反应的分析中，这些技术可以在生化反应发生的现场实时观察它们。到2018财年，我们成功地在荧光显微镜的视野内制备了DNA合成反应可视化所必需的单链DNA，并且我们能够直接观察DNA消化酶核酸外切酶III如何消化存在一个DNA分子。有趣的是，当 DNA 拉伸和松弛时，核酸外切酶 III 具有不同的消化速率。因此，今年，我们将重点关注基于单分子测量的DNA-蛋白质相互作用分析中，在控制单个DNA分子形态的同时分析反应的能力，并通过实验阐明DNA形态与DNA消化之间的关系我试过了。结果表明，当DNA被拉伸时，DNA消化的速度比松弛时快两倍多。 DNA形态与酶反应之间的关系非常有趣，这项研究可以说充分利用了单分子观察技术。此外，为了详细分析DNA-蛋白质相互作用中蛋白质的行为，我们研究了蛋白质的荧光标记方法，并证明了不抑制DNA-蛋白质相互作用的荧光标记方法。例如，我们对在 DNA 复制过程中与单链 DNA (ssDNA) 结合的复制蛋白 A (RPA) 进行荧光标记，并成功地对 ssDNA-RPA 复合物进行了单分子荧光观察。上述结果有望应用于各种DNA-蛋白质相互作用，包括DNA复制反应，并被认为有助于阐明详细行为。