DNA複製反応の1分子蛍光観察と形態制御技術の開発

DNA复制反应单分子荧光观察及形态控制技术的发展

基本信息

批准号：
18048025
负责人：
水野彰
金额：
$ 7.62万
依托单位：
Toyohashi University of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は生化学反応が起きているその場で、しかもリアルタイムで観察できる1分子観察・1分子計測技術をDNA複製反応の解析に適用することを目的とした。18年度までにDNA合成反応の可視化で必要となる1本鎖DNAを蛍光顕微鏡視野内で調製することに成功し、DNA消化酵素exonucleaseIIIが1分子のDNAを消化していく様子を直接観察している。ここで興味深いことに、exonucleaseIIIはDNAを伸張させた状態と弛緩させた状態では消化速度が異なることが示された。そこで本年度は1分子計測に基づくDNA-タンパク質間相互作用の解析ではDNA1分子の形態を制御させながら反応を解析できる点に着目し、DNAの形態とDNA消化反応の関係について実験的に明らかにすることを試みた。その結果、DNAを伸張させた場合には弛緩させた場合と比較してDNA消化速度が2倍以上速くなることが示された。DNAの形態と酵素反応の関係は非常に興味深く、1分子観察技術の利点を生かした研究であるといえる。加えてDNA-タンパク質間相互作用におけるタンパク質の詳細な挙動解析を目的としたタンパク質の蛍光標識法について検討し、DNA-タンパク質間相互作用を阻害しない蛍光標識方法を示した。その例としてDNA複製時に1本鎖DNA (ssDNA)と結合するReplication Protein A (RPA)の蛍光標識を行い、さらにssDNA-RPA複合体の1分子蛍光観察に成功した。以上の結果は、DNA複製反応をはじめとする各種DNA-タンパク質間相互作用への適用が期待され、詳細な挙動の解明に貢献できると考えられる。

这项研究旨在应用单分子观察和单分子测量技术，在生化反应的背景下可以实时观察，并分析DNA复制反应。到2018年，单链DNA可视化DNA合成反应所需的单链DNA在荧光显微镜领域成功制备，并且我们直接观察到DNA消化酶外核酸外丝线酶III如何消化一个DNA分子。有趣的是，核酸外切酶III被证明在DNA拉伸和松弛状态之间具有不同的消化率。因此，今年，我们关注的事实是，在控制DNA1分子的形态时，可以分析基于单分子测量的DNA蛋白相互作用分析，并试图在实验上阐明DNA形态和DNA消耗反应之间的关系。结果表明，与放松时，DNA消化速率的速度是DNA延长的速度的两倍以上。 DNA形态与酶反应之间的关系非常有趣，可以说这项研究利用了单分子观察技术的优势。此外，研究了一种用于蛋白质的荧光标记方法，以详细分析DNA-蛋白质相互作用中的蛋白质行为，并显示了不抑制DNA-蛋白相互作用的荧光标记方法。例如，在DNA复制过程中结合单链DNA（ssDNA）的复制蛋白A（RPA）被荧光标记，此外，SSDNA-RPA复合物的单分子荧光观察成功。预计上述结果将应用于各种DNA蛋白相互作用，包括DNA复制反应，并被认为可用于阐明详细行为。