1分子レベルのDNA-タンパク質間相互作用の解明

在单分子水平上阐明 DNA-蛋白质相互作用

基本信息

批准号：
20034028
负责人：
水野彰
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Toyohashi University of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では蛍光染色したDNAを蛍光顕微鏡視野内において1分子レベルで観察・形態制御し、溶液中のDNAとタンパク質との間で起こる生化学反応をリアルタイム1分子観察することを目的としている。前年度までに溶液交換・DNAの伸張/弛緩の制御が可能なマイクロ流路の構築や、構築した実験系を用いたDNA消化反応の1分子直接観察に成功した。また、リン脂質2重膜を用いたガラス基板修飾に着目し、上記の実験系への適用に着手した。今年度はこのリン脂質2重膜の性質と1分子DNA蛍光観察の関係について興味深い実験結果を得た。これまでにリン脂質2重膜を用いるとガラス基板表面を親水的でかつDNAおよびタンパク質の非特異的吸着を抑制できることが明らかにされた。これらに加えて、DNAに結合した蛍光色素の退色が抑制されることが見出された。この結果は蛍光顕微鏡視野内において個々のDNAを連続的に蛍光観察し、その間の蛍光強度の経時変化を数値化して得られた。リン脂質2重膜を用いない場合には約2分以内でDNAの蛍光像が判別できなくなったが、リン脂質2重膜を用いると3分以上に渡って退色が認められなかった。これは蛍光観察時に発生する活性酸素種による影響が蛍光色素よりも先にリン脂質2重膜で起こっているからではないかと考えられる。通常DNAの蛍光観察には抗酸化剤などの退色防止剤を用いるが、この退色防止剤はDNA-タンパク質間相互作用を阻害する場合がある。また脂肪酸の不飽和度を変えることでより退色抑制効果の高いリン脂質2重膜を構成できる可能性もある。従って本研究で得られた結果は1分子レベルでDNA-タンパク質間相互作用を長時間観察する上で極めて有益であると考えられる。

在这项研究中，荧光DNA旨在观察和控制单个分子水平的荧光显微镜下的DNA，并观察溶液中DNA和蛋白质之间的生化反应的单个分子。到上一年，使用构建的实验系统直接观察到可以控制溶液的微流路径，并成功地观察了DNA的扩展/放松。此外，开始使用磷脂双层膜对玻璃底物进行修饰，因此开始了上述实验系统的应用。今年，我们获得了有趣的实验，就磷脂双膜的性质与一个 - 分子DNA荧光观察之间的关系之间的关系进行了有趣的实验。已经揭示了使用磷脂双膜来抑制玻璃基板表面的非特异性吸附为亲水性，DNA和蛋白质。除此之外，还发现抑制了与DNA结合的荧光阴影的褪色。结果在荧光显微镜场中连续观察到单个DNA，并且通过量化时间来获得荧光强度的变化。如果未使用磷脂双膜，则无法在2分钟内确定DNA的荧光图像，但是使用磷脂双层膜不允许褪色超过3分钟。这可能是因为在荧光色素之前，在荧光观察过程中产生的活性氧物种的作用发生在荧光双膜中。通常，诸如抗氧化剂之类的伪造剂用于DNA的荧光观察结果，但是这种雾化的抗颜色剂可能会抑制DNA-蛋白质的相互作用。同样，通过改变脂肪酸的不饱和程度，可以配置具有较高褪色控制效果的脂质双膜。因此，在这项研究中获得的结果被认为在长期观察单分子水平的DNA-蛋白质相互作用方面非常有用。