Eph受容体型チロシンキナーゼの神経回路形成における機能解析

Eph受体酪氨酸激酶在神经回路形成中的功能分析

基本信息

批准号：
10171226
负责人：
田中英明
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10171226/
关键词：
運動ニューロンニワトリ胚 Eph 受容体型チロシンキナーゼ ephrin

项目摘要

我々はこれまでに、Eph受容体型チロシンキナーゼEphA3、EphA4がニワトリ胚運動ニューロンのサブタイプ特異的に、また発生過程に一過性に発現し、Ephファミリーのリガンドephrin-A2、ephrin-A5によりその軸索成長が阻害されることを見出し、これらのEph関連分子の生体内での機能を解析するため、機能阻害抗体を開発した。これらの機能阻害活性を持つ抗EphA4抗体#16と抗ephrin-A2抗体B3のエピトープを決定するために、それぞれのcDNAを用い、PCRにより部分cDNAをクローニングし、293細胞に発現させ細胞の免疫染色と培養上清のイムノブロットで解析した。その結果、抗EphA4抗体はシステインリッチ部分のほぼ中央、抗ephrin-A2抗体B3はN末端近くの約40アミノ酸にエピトープが存在することが明らかになり、さらに領域を小さくして解析中である。さらに、Ephファミリーは神経系以外にも様々な部位で発現されている。EphA4は形成直前、直後の体節に強く発現されているため、Newの培養法を用いて、機能阻害抗EphA4抗体をst9-13のニワトリ胚全体に投与した。体節形成そのものには変化が見出せなかったが、機能阻害抗体に曝露することにより胚全体の抗EphA4抗体染色性が消失した。この場合、in situハイブリダイゼーションでは強くシグナルが検出されたことから、細胞は生存しながらも蛋白発現が低下していると考えられた。機能阻害活性を持たない抗体ではこのようなことは生じないことから、リガンドとの相互作用によるEph受容体の安定性などに関与する現象を反映していると考えられ、さらに詳細な解析を継続している。

到目前为止，到目前为止，EPH受体酪氨酸激酶Epha3和Epha4已在鸡路堤神经元的亚型中特别表达，而EPH家族的配体Ephrin-A2，Ephrin-a5建立了轴向搜索的生长。并开发了功能抑制性抗体，以分析这些相关分子在活体中的功能。为了确定具有这些功能抑制活性的抗EPHA4抗体＃16和抗磷蛋白-A2抗体B3的表现，请使用每个cDNA通过PCR克隆局部cDNA，在293个细胞中表达它，然后在细胞中表达其免疫疾病。染色，并用培养物的干燥印迹进行分析。结果，抗EPHA4抗体已表明表位存在于N端末端附近的约40个氨基酸中，几乎是富含半胱氨酸的部分的中心，并且正在进一步分析该区域。此外，EPH家族在神经系统以外的各个部分表达。由于EPHA4在形成之前和之后立即在物理段中强烈表达，因此使用新的培养方法对整个ST9-13鸡胚胎的功能抑制性抗EPHA4抗体施用。尽管在编队本身中未发现任何变化，但对功能抑制性抗体的暴露损失了整个胚胎的抗-EPHA4抗体染色。在这种情况下，人们认为细胞存活，但是由于在原位杂交中检测到信号，蛋白质表达降低了。由于这在没有功能抑制活性的抗体中不会发生，因此它认为它由于与配体相互作用而涉及EPH受体的现象，并继续进一步分析。