Eph受容体型チロシンキナーゼの神経回路形成における機能解析

Eph受体酪氨酸激酶在神经回路形成中的功能分析

基本信息

批准号：
10171226
负责人：
田中英明
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10171226/
关键词：
運動ニューロンニワトリ胚 Eph 受容体型チロシンキナーゼ ephrin

项目摘要

我々はこれまでに、Eph受容体型チロシンキナーゼEphA3、EphA4がニワトリ胚運動ニューロンのサブタイプ特異的に、また発生過程に一過性に発現し、Ephファミリーのリガンドephrin-A2、ephrin-A5によりその軸索成長が阻害されることを見出し、これらのEph関連分子の生体内での機能を解析するため、機能阻害抗体を開発した。これらの機能阻害活性を持つ抗EphA4抗体#16と抗ephrin-A2抗体B3のエピトープを決定するために、それぞれのcDNAを用い、PCRにより部分cDNAをクローニングし、293細胞に発現させ細胞の免疫染色と培養上清のイムノブロットで解析した。その結果、抗EphA4抗体はシステインリッチ部分のほぼ中央、抗ephrin-A2抗体B3はN末端近くの約40アミノ酸にエピトープが存在することが明らかになり、さらに領域を小さくして解析中である。さらに、Ephファミリーは神経系以外にも様々な部位で発現されている。EphA4は形成直前、直後の体節に強く発現されているため、Newの培養法を用いて、機能阻害抗EphA4抗体をst9-13のニワトリ胚全体に投与した。体節形成そのものには変化が見出せなかったが、機能阻害抗体に曝露することにより胚全体の抗EphA4抗体染色性が消失した。この場合、in situハイブリダイゼーションでは強くシグナルが検出されたことから、細胞は生存しながらも蛋白発現が低下していると考えられた。機能阻害活性を持たない抗体ではこのようなことは生じないことから、リガンドとの相互作用によるEph受容体の安定性などに関与する現象を反映していると考えられ、さらに詳細な解析を継続している。

We have previously discovered that Eph receptor-type tyrosine kinases EphA3 and EphA4 are expressed specifically in subtypes of chicken embryonic motor neurons and transiently during development, and that their axonal growth is inhibited by Eph family ligands ephrin-A2 and ephrin-A5, and have developed functional inhibitory antibodies to analyze the in vivo functions of these EPH相关的分子。为了确定具有这些功能性抑制活性的抗EPHA4抗体＃16和抗磷蛋白-A2抗体B3，使用相应的cDNA克隆了部分cDNA，使用相应的cDNA在293个细胞中表达，并通过细胞的免疫抑制剂和培养培养的超级培养超级替代剂的免疫剂进行分析。结果，据揭示了表位在抗ePha4抗体的富含半胱氨酸的部分附近的大约40个氨基酸中存在，抗磷酸蛋白-A2抗体B3的位于N-末端附近的大约40个氨基酸，并且分析与该区域较小。此外，除神经系统以外，EPH家族在其他各个部位都表达。由于在形成之前和之后，EPHA4在体积上强烈表达，因此使用新培养方法对ST9-13的整个鸡胚胎施用了抑制功能抗EPHA4抗体。尽管在体积形成本身中未发现变化，但暴露于抑制性抗体会导致整个胚胎的抗EPHA4抗体染色。在这种情况下，信号在原位杂交期间被强烈检测到，并认为细胞存活但蛋白质表达降低。由于没有功能抑制活性的抗体不会发生这种情况，因此人们认为这反映了由于与配体相互作用而导致的EPH受体稳定性的现象，并且正在继续进一步的详细分析。