GFP標識プロテインキナーゼC遺伝子改変マウスの作製とその神経可塑性研究への応用

GFP标记蛋白激酶C基因修饰小鼠的产生及其在神经可塑性研究中的应用

基本信息

批准号：
10155218
负责人：
斎藤尚亮
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、培養細胞系を用いて、各PKCサブタイプ特異的なターゲッティング機構を生細胞内で明らかにするとともに、長期増強や長期抑圧現象におけるPKCの細胞内動態を解析することにより、PKCのシナプス可塑性における働きを明らかにすることを目的とした。そのために、1)培養細胞系におけるGFP標識PKC各分子種のトランスロケーション現象と活性化機構の関連についての解析、2)GFP標識PKCトランスジェニックマウスの作製の試みを行った。その結果、1)γ-,δ-,ε-PKCすべてが、G蛋白質共役型ATP受容体刺激により、20sec以内に細胞膜にtranslocationし、3min以内に元の状態に戻る(Retranslocation)。しかし、ホルボールエステル刺激によっては、すべての分子種が比較的ゆっくりと(3-5min)ranslocationし、そのまま膜にとどまる。つまり、同一の分子種であっても、刺激により異なるターゲッティング機構を持つことが示された。2)アラキドン酸刺激により、γ-PKCは素早く細胞膜に、ε-PKCはややゆっくりとGolgi体周辺にtranslocationするのに対して、δ-PKCはtranslocationしない。つまり、同一の刺激によっても分子種によってtargeting部位(translocation)は異なることが示された。3)δ-PKCを活性化する3種の刺激(ATP,TPA,H202)は、それぞれ異なるターゲッティング機構によるものであり、細胞の機能に対する調節機構も異なると推測される。以上の結果から、PKCのターゲッティング機構は、分子種特異的、刺激特異的でありしかも時間的、空間的にも異なっていることが示され、ターゲッティング機構の解析はPKC分子種独自の機能の解明に有力な方法と考えられた。

在本研究中，我们利用培养细胞系统阐明了活细胞中各PKC亚型特异的靶向机制，并分析了PKC在长期增强和长期抑制现象期间的细胞内动态，旨在阐明其作用。突触可塑性。为此，我们1）分析了培养细胞系中GFP标记的PKC各分子种类的易位现象和激活机制之间的关系，2）尝试创建GFP标记的PKC转基因小鼠。结果，1) γ-、δ-和ε-PKC全部在G蛋白偶联ATP受体刺激下在20秒内易位至细胞膜，并在3分钟内恢复到其原始状态（重易位）。然而，在佛波酯刺激下，所有分子种类的移位相对较慢（3-5 分钟）并保留在膜中。换句话说，研究表明，即使是相同的分子种类，也会根据刺激的不同而具有不同的靶向机制。 2) 在花生四烯酸刺激下，γ-PKC 快速易位至细胞膜，ε-PKC 在高尔基体周围稍慢地易位，而 δ-PKC 则不易位。换句话说，即使施加相同的刺激，目标位点（易位）也会根据分子种类而不同。 3）激活δ-PKC的三种刺激（ATP、TPA、H2O2）基于不同的靶向机制，并且假设细胞功能的调节机制也不同。上述结果表明PKC的靶向机制具有分子物种特异性和刺激特异性，并且在时间和空间上也存在差异，被认为是一种有效的方法。