顔面神経切断に伴って増殖する反応性ミクログリアにおけるカテプシンEの性状解析

面神经横断后增殖的反应性小胶质细胞中组织蛋白酶 E 的表征

• 批准号: 08672130
• 负责人: 中西 博
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08672130/
• 关键词: 初代培養ミクログリア; カテプシンE; 生合成; プロセッシング; エンドソーム; 糖鎖

最近、反応性ミクログリアがさまざまな神経疾患の病態において重要な役割を果していることが示唆されている。即ち、神経疾患に陥るとミクログリアはいち早く反応し、反応性ミクログリアとして増殖、移動し、防御あるいは組織修復に関与すると考えられている。顔面神経切断時においても顔面神経核周囲に反応性ミクログリアが増加することが知られており、逆行性変性あるいは修復過程において反応性ミクログリアが重要な役割を担っていることを示唆している。我々は非リソソーム性アスパラギン酸プロテアーゼであるカテプシンEが反応性ミクログリアにおいて増大することを見い出した。カテプシンEは静止状態のグリア細胞や反応性アストロサイトには殆ど認められないことから、本酵素の発現増大が反応性ミクログリアの機能と密接に関係している可能性が考えられる。そこで本研究は反応性ミクログリアにおけるカテプシンEの生理機能の解明を最終目的とし、初代培養ミクログリアを用いカテプシンEの細胞内輸送路、活性化機構ならびに分泌機構を検討した。今回の研究結果より次のことが明らかとなった。1.間接蛍光抗体法によりカテプシンEは初代培養ミクログリアにおいてエンドソーム様の局在を示していた。2.S-メチオニンを用いたパルスチェイス解析により、カテプシンEは還元条件下で46kDaのプロ酵素として生合成された後、中間体を経て4時間後には42kDaの成熟型にプロセッシングされることが分かった。また一部は生合成された後、中間体を経て4時間後には42KDaの成熟型にプスセッシングされることが分かった。また一部は生合成された後、プロ型分子のままで細胞外に分泌された。3.蛋白質の輸送経路を修飾するバフィロマイシンAならびにブレフェルディンA1を加え、カテプシンEの細胞内輸送、プロセッシング機構あるいは分泌機構への影響を調べた。その結果、バフィロマイシンAならびにブレフェルディンA1存在下ではカテプシンEのプロセッシングは完全に阻害された。一方、バフィロマイシンA1存在下では細胞外に分泌されるプロ型分子は増加したが、ブレフェルディンA存在下では細胞外への分泌も阻害された。4.糖鎖による修飾状態を知る目的でエンドグリコシダーゼHの処理を行った結果、生合成直後のプロ型酵素はエンドグリコシダーゼHの処理により分子量の低下が認められたが、成熟型酵素では大部分が影響を受けなかった。以上の結果より、カテプシンEはミクログリアの粗面小胞体においてプロ型酵素として生合成された後、ゴルジ装置を経て細胞内酸性コンパートメント(エンドソーム)に輸送され成熟型に変換され、一部はゴルジ装置を経てプロ型酵素のままで細胞外に分泌されることが分かった。また、カテプシンEの糖鎖はプロセッシングに伴い高マンノース型から一部は複合型に変換されることが分かった。

最近，有人提出反应性小胶质细胞在各种神经疾病中发挥了重要作用。换句话说，人们认为小胶质细胞反应迅速，成长，作为一种反应性小胶质细胞运动，并在神经系统疾病中涉及防御或组织修复。众所周知，在面神经切割过程中，反应性小胶质细胞在面神经核周围增加，这表明反应性小胶质细胞在逆行或修复过程中起重要作用。我们发现，一种非疗程的天质蛋白酶Catepsin E的反应性小胶质细胞正在增加。由于组织蛋白酶E在固定的神经胶质细胞和反应性星座上很少被识别，因此该酶表达的增加可能与反应性小胶质细胞的功能密切相关。因此，这项研究是阐明在反应性小胶质细胞中组织蛋白酶E的生理功能的最终目的，并使用原始培养物小胶质细胞检查了细胞内转运途径，激活机制和分泌机制。揭示了以下研究结果。 1。间接荧光抗体方法显示了末端败血症的第一个代代小胶质细胞中的组织蛋白酶E。 2。使用S-Methionine的脉搏分析表明，在中间体被用作42KDA成熟类型之后，组织蛋白酶E是42KDA成熟的类型。发现在生物合成4小时后，其中一些人被鼠尾草成42kDa。生物合成后，它被专业分子在细胞外分泌。 3。添加了修改蛋白质的转运途径的双霉素A和Brefeldin A1，以检查组织蛋白酶E的细胞内转运，加工或分泌机制的影响。结果，在Bapapairosycin A和Brefeldin A1的存在下完全抑制了Catepsin e的加工。另一方面，在存在巴菲霉素A1的情况下，细胞外分泌的专业分子数量增加，但是在布雷氏素A的存在下，也抑制了细胞外细胞的分泌。 4。由于治疗末端糖苷酶H的结果是为了了解糖链引起的修饰状态，因此在生物合成后立即通过治疗末端糖苷酶H的治疗而在生物合成后立即进行了分子量，但是大多数成熟的酶不受影响。基于上述结果，在小胶质细胞底物中将组织蛋白酶E作为专业酶进行生物合成，然后通过峡谷设备将其转换为内体隔室（Endome），并将其转换为成熟的类型，并发现该类型的设备部分华丽的设备。它被专业酶在牢房外分泌。此外，发现组织蛋白酶E的糖链从高含量的类型转换为带有加工的复合类型。

项目成果

Nakanishi,H.et al.: "Protective effect of MK-801 on the anoxia-aglycemia induced damage in the fluorocitrate-treated hippocampal slice of the rat." Brain Research. 732. 232-236 (1996)

Nakanishi, H. 等人：“MK-801 对氟柠檬酸盐处理的大鼠海马切片中缺氧血糖引起的损伤的保护作用。”

Nakanishi,H.et al.: "Incresed expression of cathepsins E and D in neurons of aged rat brain and their colocalization with lipofuscin and carboxy-terminal fragments of Alzheimer amyloid precursor prothein." J.Neurochem.68. 739-749 (1997)

Nakanishi, H. 等人：“老年大鼠大脑神经元中组织蛋白酶 E 和 D 的表达增加，及其与脂褐质和阿尔茨海默淀粉样蛋白前体蛋白的羧基末端片段的共定位。”

Nakanishi,H.et al.: "Electrophysiological studies of rat substantia nigra neurons in an in vitro slice preparation after middle cerebral artery occlusion." Neuroscience. (in press). (1997)

Nakanishi,H.et al.：“大脑中动脉闭塞后体外切片制备中大鼠黑质神经元的电生理学研究。”