アスパラギン酸プロテアーゼによる生理活性ペプチドの分解を介した三叉神経機能の調節

通过天冬氨酸蛋白酶降解生物活性肽调节三叉神经功能

• 批准号: 06671861
• 负责人: 中西 博
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06671861/
• 关键词: カテプシンE; カテプシンD; アスパラギン酸プロテアーゼ; basic FGF; 分解調節; 咬筋運動ニューロン; 免疫組織化学; 酵素活性

最近、カテプシンEならびにDがサブスタンスP等のタキキニン類やfibrobrast growth factor(FGF)等の成長因子を中性領域において非常によく分解することが報告されている。生理活性ペプチドの機能は分解酵素の活性により調節されることが知られており、カテプシンEならびにカテプシンDとの関連が注目される。特にbasicFGF(bFGF)は三叉神経中脳路核に存在する咬筋運動ニューロンならびに咬筋との接合部に高濃度に存在しており、咬筋に対する成長栄養因子または神経伝達修飾物質として働くことが示唆されている。そこで本研究は細胞内の主要なアスパラギン酸プロテアーゼであるカテプシンEならびにDがbFGFの分解調節を介して三叉神経機能(侵害受容、咀嚼運動あるいは顎反射など)を修飾している可能性について検討することを目的として行った。実験には若齢(2ケ月月齢)ならびに老齢(30ケ月齢)ラットを用い、咬筋におけるカテプシンE、DならびにbFGFの局在を調べるとともに酵素活性を検討した。一次抗体としてはカテプシンE、Dポリクロナール抗体ならびに抗bFGFモノクロナール抗体(bFM-1)を用い、ABC法により免疫染色を行った。また酵素活性の測定では酸変性ヘモグロビンを基質として行った。今回の実験結果より次のことが明らかとなった。(1)カテプシンDはリソソームを示唆する顆粒状の免疫反応物として、咬筋運動ニューロンの終末ボタン内に円盤状に局在していた。(2)一方、カテプシンEは咬筋運動ニューロンの終末部にディフューズな免疫反応物として認められた。(3)カテプシンDならびにEの咬筋における局在様式には、加齢による著明な変化は認められなかった。(4)bFM-1は0.02-2μg/mlの希釈で用いたが、いずれの場合も特異的な染色は得られなかった。(5)カテプシンDならびにEの酵素活性は若齢ならびに老齢ラットにおいて著明な差異は認められなかった。以上の結果より、カテプシンDならびにEは咬筋運動ニューロンの終末に局在していることが分かり、両酵素が神経終末部において生理活性ペプチドの分解調節を介して咬筋運動ニューロン機能を修飾している可能性が強く示唆された。今後、bFGFを含む生理活性ペプチドとカテプシンDならびにEが咬筋運動ニューロン終末部において共存するかどうかを免疫組織化学的にさらに検討したいと考えている。

最近，据报道，组织蛋白酶E和D在中性区域很好地降解P物质等速激肽和成纤维细胞生长因子(FGF)等生长因子。众所周知，生物活性肽的功能受降解酶的活性调节，其中与组织蛋白酶E和组织蛋白酶D的关系值得注意。特别是，碱性FGF（bFGF）以高浓度存在于三叉神经中脑束核的咬肌运动神经元中以及与咬肌的连接处，并且已被建议充当咬肌的生长营养因子或神经传递调节剂肌肉有。因此，本研究探讨了组织蛋白酶 E 和 D（细胞内主要的天冬氨酸蛋白酶）通过调节 bFGF 降解来改变三叉神经功能（例如伤害感受、咀嚼运动或下颌反射）的可能性。实验采用幼龄（2月龄）和老年（30月龄）大鼠，研究组织蛋白酶E、D和bFGF在咬肌中的定位以及酶活性。使用组织蛋白酶E和D多克隆抗体以及抗bFGF单克隆抗体(bFM-1)作为一抗，通过ABC法进行免疫染色。此外，使用酸变性血红蛋白作为底物测量酶活性。该实验的结果揭示了以下内容。 (1) 组织蛋白酶 D 以盘状方式定位于咬肌运动神经元的末端，是一种提示溶酶体的颗粒状免疫反应物质。 (2)另一方面，在咬肌运动神经元末端观察到组织蛋白酶E作为弥散的免疫反应物。 (3)组织蛋白酶D和E在咬肌中的定位没有观察到与年龄相关的显着变化。 (4)bFM-1以0.02-2μg/ml稀释使用，但均未获得特异性染色。 (5)组织蛋白酶D、E酶活性在幼龄和老年大鼠之间无显着性差异。上述结果表明组织蛋白酶D和E定位于咬肌运动神经元末端，这两种酶通过调节神经末端生物活性肽的降解来改变咬肌运动神经元功能的可能性被强烈暗示。未来，我们希望利用免疫组织化学进一步研究包括bFGF和组织蛋白酶D和E在内的生物活性肽是否共存于咬肌运动神经元末梢。

项目成果

中西博、山本健二: "神経細胞死と細胞内プロテアーゼ" 日本薬理学雑誌. 105. 1-9 (1995)

Hiroshi Nakanishi、Kenji Yamamoto：“神经细胞死亡和细胞内蛋白酶”日本药理学杂志 105. 1-9 (1995)。

H.Nakanishi et al.: "Age-related changes in activities and localilzations of catepsins D,E,B and L in the rat brain tissues." Exp.Neurol.126. 119-128 (1994)

H.Nakanishi 等人：“大鼠脑组织中组织蛋白酶 D、E、B 和 L 的活性和定位与年龄相关的变化。”