造血幹細胞を標的とした新たなレトロウイルスベクター系の作成

创建针对造血干细胞的新型逆转录病毒载体系统

• 批准号: 08671228
• 负责人: 伊藤 克彦
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08671228/
• 关键词: 遺伝子治療; 造血幹細胞; レトロウイルス; 転写活性; ベクター; モロニ-ウイルス; フレンドウイルス; LTR

本研究では、以下のことを目的として研究を行った。(1)まず、種々のレトロウイルスのLTRをサブクローニングして得たレポーター用プラスミドを、造血幹細胞株を用いて遺伝子発現を検定し、レトロウイルスベクターの基本骨格を確定する。(2)つぎに、ストローマ細胞を用いたウイルスパッケージング細胞を確立する。その結果、以上のような研究結果を得た。(1)造血幹細胞株においては、MoMuLV,myeloproliferative sarcoma virus(MPSV),PCC4-cell-passaged MPSV,malignant histiocytosis sarcoma virusのU3に比べて、spleen focus-forming virus(SFFVp)のU3により高いプロモーター活性が認められた。また、MPSVのleader領域にあるprimer binding site(PBS;tRNAPro)は、幼若な造血細胞株でのレトロウイルスの転写活性を抑制し、一過性のレポーター発現量を減少させたが、murine ES cell virus(MESV)のPBS(tRNAGlu)を用いれば、転写抑制が認められなかった。以上の結果より、SFFVpのLTRとMESVのleader領域とを組み合わせたベクターを作成した。このベクターを用いて幼若な造血細胞株での良好な遺伝子発現を確認中である。(2)パッケジングシグナル部分の欠損したヘルパーウイルスより、gag/polをコードする部分を得て、これを発現ベクターにクローニングした。また、env蛋白質をコードする部分を別個の発現ベクターにクローニングした。これらのプラスミドをストローマ細胞株(MS-5)に導入したウイルスパッケージング細胞を樹立中である。

在本研究中，我们出于以下目的进行了研究。 (1)首先，使用造血干细胞系测定通过亚克隆各种逆转录病毒的LTR而获得的报告质粒的基因表达，以确定逆转录病毒载体的基本框架。 (2)接下来，利用基质细胞建立病毒包装细胞。结果，得到了上述研究结果。 (1)在造血干细胞系中，脾病灶形成病毒(SFFVp)的U3比MoMuLV、骨髓增殖肉瘤病毒(MPSV)、PCC4细胞传代的MPSV、恶性组织细胞增多症病毒的U3具有更高的启动子活性。此外，MPSV前导区的引物结合位点（PBS；tRNAPro）抑制了年轻造血细胞系中逆转录病毒的转录活性，并降低了瞬时报告基因表达水平，但小鼠ES在使用PBS（tRNAGlu）时未观察到转录抑制。使用细胞病毒（MESV）。基于上述结果，创建了结合SFFVp的LTR和MESV的前导区的载体。我们目前正在使用该载体确认年轻造血细胞系中良好的基因表达。 (2)从缺乏包装信号部分的辅助病毒中获得编码gag/pol的部分，并将其克隆到表达载体中。另外，编码env蛋白的部分被克隆到单独的表达载体中。我们目前正在通过将这些质粒引入基质细胞系（MS-5）来建立病毒包装细胞。

项目成果

K.Okumura et al.: "Expression of a novel isoform of Vav,Vav-T,containing a single Src homology 3 domain in murine testicular germ cells" Oncogene. (in press).

K.Okumura 等人：“Vav、Vav-T 的新型亚型在小鼠睾丸生殖细胞中的表达，包含单个 Src 同源 3 结构域”Oncogene。

K.Itoh et al.: "A novel hematopoietic multilineage clone,Myl-D-7,is stromal cell-dependent and supported by an alternative mechanismcs independent of stem cell factor/c-kit interaction" Blood. 87. 3218-3228 (1996)

K.Itoh 等人：“一种新型造血多谱系克隆，Myl-D-7，是基质细胞依赖性的，并由独立于干细胞因子/c-kit 相互作用的替代机制支持”血液。