粗面小胞体を用いたアルファ2プラスミンインヒビターの輸送障害のメカニズムの研究

利用粗面内质网研究α2纤溶酶抑制剂转运受损的机制

基本信息

批准号：
08671218
负责人：
広沢信作
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

アルファ2プラスミンインヒビター(α2 plasmin inhibitor、以下α2PIと略す)は、線溶系の重要な因子である。日本の一家系の異常は、1塩基の挿入によるフレームシスにより、C末端の12個のアミノ酸が178個の別のアミノ酸に置換(α2PI-Nara)される。発現実験により、欠損症では粗面小胞体のレベルで変異蛋白の輸送が障害されていることが、今回、粗面小胞体の中における分解のメカニズムについて検討した。正常のα2PIとα2PI-NaraのcDNAを、T7のプロモーターを持つベクターpBlueScriptの下流に挿入し、mRNAを合成した。粗面小胞体の調製は、50A_<280> units/mlの最終濃度として使用した。合成したmRNAを網赤血球のライセ-トを用いたin vitro translationの系にて、翻訳を行い、25℃にて40分蛋白合成させた。変異蛋白(α2PLI-Nara)が正常蛋白より、明らかに分子量の大きな蛋白となるため、蛋白のサイズから移行を確認することができた。また、エンドグルコシダーゼHによる検討より糖鎖の負荷が5ヶ所に確認された。次に、粗面小胞体の小胞体内へ移行した正常ないし蛋白の小胞体内での処理機構について検討した。正常蛋白は翻訳移行後、30℃200分まで観察したが、分解は全くみられなかった。一方、変異蛋白は60分から分解がみられ、90分では、ほとんど分解された。変異蛋白の分解に対する温度の影響を検討したが、4℃、15℃ではほとんどみられなかった。本法法により、粗面小胞体における分解の検討が可能となった。変異蛋白の分解に関与するプロテアーゼについても検討中である。

α2纤溶酶抑制剂（α2纤溶酶抑制剂，以下简称为α2PI）是纤维蛋白溶解系统的重要因素。日本家族的异常是，通过插入一个碱基的框架，C-末端的12个氨基酸被178个其他氨基酸（α2PI-NARA）取代。在表达实验中，我们研究了粗糙的内质网中降解机制，这会损害突变蛋白在粗糙内质网的水平上的转运。将正常的α2Pi和α2Pi-Nara cDNA插入了具有T7启动子的载体pbluescript的下游，并合成mRNA。粗糙的内质网的制备用作最终浓度为50a_ <280>单位/ml。使用网状致电牌照在体外翻译系统中翻译合成的mRNA，并在25°C下进行蛋白质合成40分钟。突变蛋白（α2PLI-NARA）显然是一种比正常蛋白更大的蛋白质，因此根据蛋白质大小确认过渡。此外，一项使用内糖苷酶H的研究证实，在五个位置发现了糖链的负载。接下来，我们研究了在内质网中迁移到内质网中的正常或蛋白质的机制。翻译转移后在30°C下观察到正常蛋白，但未观察到降解。另一方面，突变蛋白从60分钟开始降解，几乎在90分钟后退化。研究了温度对突变蛋白降解的影响，但在4°C和15°C下几乎没有观察到。这种方法使研究在粗糙的内质网中的分解成为可能。还研究了参与突变蛋白降解的蛋白酶。