変異蛋白質のプロテアゾーム分解における糖鎖のトリミングの役割

聚糖修剪在突变蛋白蛋白酶体降解中的作用

基本信息

批准号：
12670975
负责人：
広沢信作
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

日本における2家系のプラスミンインヒビター欠乏症(PI-Nara、PI-Okinawa)の遺伝子変異を有する発現するベクターを導入して樹立したstable cell lineを用いて一連のパルスチェイス実験を行った。細胞は正常および2種類の変異PI蛋白(PI-Nara、PI-Okinawa)を発現している。ハイマンノース型の糖鎖(Glu3Man9GlNac2)のうち、グルコースのトリミングをおこなうグルコシダーゼを阻害するcastanospermine (CAS)あるいは、マンノースのトリミングに関与するmannojirimycin (MNJ)を用いた。プロテアソームの阻害剤としては、ALLNやラクタシスチンを使用した。正常PI蛋白は2時間以内に細胞から分泌され、1時間で既に分泌された。一方、2種類の変異蛋白は細胞内に留まり、半減期は大体4時間であった。ALLNあるいはLCTを添加すると、変異蛋白の分解は著明に阻害された。dMMの阻害の程度はLCTと同程度であった。dMMとLCTとの同時添加では阻害は相加的ではなかった。これらの結果から、マンノースのトリミングを阻害しても、プロテアソームによる分解を阻害しても結果としては共通の経路で阻害がおこっていると推測された。プロテアソームはユビキチン化された蛋白を分解するが、変異PI蛋白はユビキチン化されていなかった。CSTによりグルコーストリミングが阻害すると分解は著明に亢進した。正常蛋白と比較して、変異蛋白はカルネキシン(CNX)との結合時間と結合量が多かった。CST添加では、正常及び変異蛋白ともCNXとの結合が阻害された。以上より、変異蛋白はマンノースがはずれる(トリミング)と分解が開始されること、分解はプロテアソームでおこることが明らかにされた。グルコーストリミングが阻害されてもマンノーストリミングはおこり、プロテアソームで分解されることも明らかにされた。

使用通过引入表达纤溶酶抑制剂缺陷的两个日本家族（PI-Nara 和 PI-Okinawa）的基因突变的载体而建立的稳定细胞系进行了一系列脉冲追踪实验。这些细胞表达正常和两种类型的突变 PI 蛋白（PI-Nara 和 PI-Okinawa）。在高甘露糖型糖链(Glu3Man9G1Nac2)中，使用了抑制葡萄糖苷酶的栗精胺(CAS)和参与甘露糖修剪的甘露尻霉素(MNJ)。 ALLN 和乳胞素用作蛋白酶体抑制剂。正常PI蛋白在2小时内从细胞中分泌出来，并在1小时内就已经分泌出来。另一方面，两种突变蛋白保留在细胞内，半衰期约为 4 小时。添加ALLN或LCT显着抑制突变蛋白的降解。 dMM的抑制程度与LCT相似。同时添加 dMM 和 LCT 时，抑制作用不会叠加。从这些结果推断，即使甘露糖修剪被抑制或蛋白酶体降解被抑制，该抑制也是通过共同途径发生的。蛋白酶体降解泛素化蛋白，但突变的 PI 蛋白并未泛素化。当 CST 抑制葡萄糖修饰时，降解明显加速。与正常蛋白相比，突变蛋白与钙联蛋白（CNX）的结合时间和结合量更长。添加 CST 可抑制正常蛋白和突变蛋白与 CNX 的结合。由上可知，当甘露糖被去除(修剪)时，突变蛋白开始被降解，并且该降解发生在蛋白酶体中。还表明，即使葡萄糖修饰受到抑制，甘露糖修饰也会发生，并且它会被蛋白酶体降解。