変異蛋白質のプロテアゾーム分解における糖鎖のトリミングの役割

聚糖修剪在突变蛋白蛋白酶体降解中的作用

基本信息

批准号：
12670975
负责人：
広沢信作
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

日本における2家系のプラスミンインヒビター欠乏症(PI-Nara、PI-Okinawa)の遺伝子変異を有する発現するベクターを導入して樹立したstable cell lineを用いて一連のパルスチェイス実験を行った。細胞は正常および2種類の変異PI蛋白(PI-Nara、PI-Okinawa)を発現している。ハイマンノース型の糖鎖(Glu3Man9GlNac2)のうち、グルコースのトリミングをおこなうグルコシダーゼを阻害するcastanospermine (CAS)あるいは、マンノースのトリミングに関与するmannojirimycin (MNJ)を用いた。プロテアソームの阻害剤としては、ALLNやラクタシスチンを使用した。正常PI蛋白は2時間以内に細胞から分泌され、1時間で既に分泌された。一方、2種類の変異蛋白は細胞内に留まり、半減期は大体4時間であった。ALLNあるいはLCTを添加すると、変異蛋白の分解は著明に阻害された。dMMの阻害の程度はLCTと同程度であった。dMMとLCTとの同時添加では阻害は相加的ではなかった。これらの結果から、マンノースのトリミングを阻害しても、プロテアソームによる分解を阻害しても結果としては共通の経路で阻害がおこっていると推測された。プロテアソームはユビキチン化された蛋白を分解するが、変異PI蛋白はユビキチン化されていなかった。CSTによりグルコーストリミングが阻害すると分解は著明に亢進した。正常蛋白と比較して、変異蛋白はカルネキシン(CNX)との結合時間と結合量が多かった。CST添加では、正常及び変異蛋白ともCNXとの結合が阻害された。以上より、変異蛋白はマンノースがはずれる(トリミング)と分解が開始されること、分解はプロテアソームでおこることが明らかにされた。グルコーストリミングが阻害されてもマンノーストリミングはおこり、プロテアソームで分解されることも明らかにされた。

使用稳定的细胞系进行了一系列的脉冲追逐实验，这些实验是通过引入日本两个家庭中纤溶酶抑制剂缺乏症（Pi-Nara，Pi-Nara，Pi-Nara，Pi-Nara，Pi-Nara）引入突变的表达载体建立的。细胞同时表达正常和两个突变的PI蛋白（PI-NARA，PI-OKINAWA）。在抑制葡萄糖或Mannojirimycin（MNJ）的高甘露糖型聚糖（GLU3MAN9GLNAC2）中，使用了糖苷（CAS），该糖苷与糖粉相关。 Alln和Lactacystin用作蛋白酶体的抑制剂。正常的PI蛋白在2小时内从细胞中分泌，并在1小时内分泌。另一方面，两个突变蛋白保留在细胞中，其半衰期约为4小时。 Alln或LCT的添加显着抑制了突变蛋白的降解。 DMM的抑制程度与LCT相似。当同时添加DMM和LCT时，抑制不是加性的。这些结果表明，即使抑制甘露糖的修剪或蛋白酶体降解，也会通过公共途径进行抑制。蛋白酶体降解了泛素化蛋白，但突变的PI蛋白没有泛素化。当CST抑制葡萄糖修剪时，降解显着增加。与正常蛋白相比，突变蛋白具有更大的结合时间和与钙钙蛋白酶（CNX）的结合量。添加CST抑制与正常蛋白和突变蛋白的CNX结合。从上面可以揭示出突变蛋白的降解在去除甘露糖（修剪）时开始，并且该降解发生在蛋白酶体中。还揭示了即使蛋白酶体抑制葡萄糖并降解葡萄糖，也会发生mannostrimming。