変異体の選択的破壊によるミトコンドリアゲノム制御の基礎研究

通过选择性破坏突变体调控线粒体基因组的基础研究

• 批准号: 08457047
• 负责人: 田中 雅嗣
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Institute of Applied Biochemistry (1997)Nagoya University (1996)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 1997
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08457047/
• 关键词: ミトコンドリア脳筋症; F_0F_1-ATPase; 制限酵素; シグナルペプチド; チトクロームオキシダーゼ; ミトコンドリア; 遺伝子治療; 緑色蛍光蛋白質; ミトコンドリア遺伝子; 融合蛋白質; Leigh脳症; ミトコンドリア病

本研究では、ミトコンドリア脳筋症・心筋証において見いだされるミトコンドリアDNAの塩基番号8993のT*G塩基転換を特異的に除去することを目指した。この変異によってF_0F_1-ATPaseのATP6サブユニットにLeu*Arg置換が生じ、そのプロトンチャンネル機能に異常が生じATP合成が低下する。この変異によって制限酵素SmaIの切断部位が出現する。正常型mtDNAにはSmaIの認識配列が存在しないため、変異型mtDNAのみを特異的に破壊することが可能である。制限酵素SmaIをミトコンドリアのマトリックス酵素であるオルニチントランスカルバミラーゼのシグナルペプチドとの融合タンパク(OTC-SmaI)として合成させ、ミトコンドリア内へ選択的に輸送させた。OTC-SmaIのミトコンドリアへの輸送を確認するために緑色蛍光蛋白質(GFP)との融合蛋白質を細胞内に発現させたが、ミトコンドリアの蛍光は弱く、多くの細胞が剥離し、導入効率が低かった。発見したOTC-SmaIがミトコンドリアから核へ漏出し、核DNAを破壊するために致死的となると推定された。制限酵素EcoRIに、より強力なシグナル活性を有するCOXIV(チトクロームオキシダーゼの第4サブユニット)のシグナルを付けた融合蛋白(COXIV-EcoRI)をgalactoseプロモータの制御の下で酵母で発見させた。その発現により、ミトコンドリアDNAが消失したが、細胞毒性も強いことが明らかになった。そこで安全装置としてCOXIV-EcoRIを発現するプラスミド自身にEcoRIによる切断部位を導入した。これによって、核にEcoRIが到達した時には、プラスミド自身がEcoRIによって破壊され、COXIV-EcoRIの発現を停止させることによって、核DNAの破壊を防止できた。ミトコンドリアへの移入活性の強いシグナルの選択と発現のON/OFF制御が重要であると結論された。

在这项研究中，我们的目的是特异性地消除线粒体脑肌病和心肌证明的线粒体DNA的基本数量8993的基础数字8993。该突变导致F_0F_1-ATPase的ATP6亚基中的Leu*arg取代，导致其质子通道功能异常，从而导致ATP合成降低。该突变导致裂解位点的出现用于限制酶SMAI。由于在正常的mtDNA中不存在SMAI识别序列，因此只能专门破坏突变体mtDNA。限制酶SMAI被合成为融合蛋白（OTC-SMAI）与鸟氨酸经钙化酶的信号肽，一种线粒体基质酶，并选择性地转运到线粒体中。为了确认OTC-SMAI到线粒体的转运，细胞内表达具有绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白，但线粒体荧光较弱，许多细胞被分离，导致透射率较低。发现的OTC-SMAI从线粒体泄漏到核中，并被认为是致命的，因为它会破坏核DNA。在酵母中发现了限制性酶ECORI，这是在半乳糖启动子的控制下，由Coxiv（Coxiv-Ecori）信号（细胞色素氧化酶的第四个亚基（细胞色素氧化酶的第四个亚基））。线粒体DNA的表达丢失，但也揭示为高度细胞毒性。因此，作为安全装置，ECORI将切割位点引入了表达Coxiv-Ecori本身的质粒中。这阻止了核DNA在ECORI到达核时被ECORI破坏，并且通过阻止Coxiv-Ecori的表达，可以防止核DNA破坏。得出的结论是，选择线粒体转移活性的强信号和表达的ON/OFF调节很重要。

项目成果

Tanaka M: "Automated sequencing of mitochondrial DNA." Methods Enzymol.264. 407-421 (1996)

Tanaka M：“线粒体 DNA 的自动测序。”

Islam MM: "Primary structure of the Smallest(6.4-kDa)subunit of human and bovine ubiquinol-cytochrome c reductase deduced from cDNA sequences." Biochem.Mol.Biol.Int.41. 1109-1119 (1997)

Islam MM：“从 cDNA 序列推导出的人类和牛泛醇细胞色素 c 还原酶最小 (6.4-kDa) 亚基的一级结构。”

Tanaka M: "Mitochondrial genotype associated with longevity" Lancet. 351. 185-186 (1998)

田中 M：“与长寿相关的线粒体基因型”《柳叶刀》。

Nakamura N: "Specific detection of deleted mitochondrial DNA by in situ hybridization using a chimera probe." Biochim.Biophys.Acta. 1308. 215-221 (1996)

Nakamura N：“使用嵌合探针通过原位杂交特异性检测缺失的线粒体 DNA。”

Morikawa S: "Increases mitochondrial damage by lipid peroxidation in trophoblast cells of preeclamptic placentas." Biochem.Mol.Biol.Int.41. 767-775 (1997)

Morikawa S：“通过先兆子痫胎盘滋养层细胞中的脂质过氧化增加线粒体损伤。”