大腸菌ATP合成酵素:γサブユニット変異酵素を用いたエネルギー共役機構の解明

大肠杆菌 ATP 合酶：利用 γ 亚基突变酶阐明能量耦合机制

基本信息

批准号：
10780379
负责人：
木原昌子
金额：
$ 0.38万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10780379/
关键词：
ATP合成酵素 F_0F_1 F_1-ATPase エネルギー共役 γサブユニット分子集合

项目摘要

本研究では,ATP合成酵素(F_0F_1-ATPase)におけるH^+輸送とATP合成(分解)の間のエネルギー共役機構の解明を目的として,F_1およびF_0F_1の複合体におけるγサブユニットおよびcサブユニットオリゴマーの回転を,それぞれのサブユニットに結合したアクチンフィラメントの回転によって観察した.γサブユニットのγSer-193をCys残基に置換し,ビオチン-PEAC_5-マレイミドにてビオチン化した後,ストレプトアビジンを介して,ファロイジンでラベルしたアクチンフィラメントを結合した.α_3β_3複合体をガラス板に固定して,定常状態のATPase反応が起こる条件でATPの加水分解によるアクチンフィラメントの回転トルクを測定したところ,野生型F_1では約40pN・mが得られ,ATPの加水分解のエネルギーが非常に効率よく回転に変換されていた.同じ実験を,エネルギー共役機構の損なわれている,γMet-23→Lys変異を持つF_1を用いて行ったところ,野生型F_1と同様のトルクが得られた.したがって,γMet-23→Lys酵素は,γの回転による仕事量がH^+の輸送の仕事に伝達されにくい変異酵素であることが明らかになった.次に,H^+輸送路を形成するcサブユニットのα_3β_3複合体に対する回転を観察した.cサブユニットにCys残基を導入し同様にアクチンフィラメントの回転トルクを測定したところ,野生型のF_0F_1では,cサブユニットオリゴマーはγサブユニットと同様のトルクでα_3β_3複合体に対して回転していることが明らかになった.すなわちγサブユニットとcサブユニットは酵素内の回転子であり,それらが共に回転することが触媒とH^+輸送の共役に重要であると考えられる.以上の成果はProc.Natl.Acad.Sci.USAおよびScienceに報告した.

在本研究中，我们旨在阐明ATP合酶（F_0F_1-ATPase）中H^+转运和ATP合成（降解）之间的能量耦合机制。通过与每个亚基结合的肌动蛋白丝的旋转来观察α和c亚基寡聚物的旋转，将γ亚基的γSer-193替换为Cys残基，并添加生物素-PEAC_5-马来酰亚胺。逐步进行生物素化后，鬼笔环肽标记的肌动蛋白丝通过链霉亲和素结合。将α_3β_3复合物固定在玻璃板上，并在发生稳态ATP酶反应的条件下进行ATP添加。当我们测量肌动蛋白丝因水分解而产生的旋转扭矩时，我们在野生型F_1中获得了大约40 pN·m，这表明ATP水解的能量非常有效地转化为旋转。当使用具有受损的γMet-23→Lys突变的F_1时，获得与野生型F_1相同的扭矩是H^+传输功。接下来，我们观察了形成H^+运输途径的c亚基相对于α_3β_3复合物的旋转。我们将Cys残基引入到c亚基肌动蛋白丝中并获得了类似的结果。当我们测量野生型中F_0F_1的旋转扭矩时，发现c亚基寡聚体相对于α_3β_3复合物以与γ亚基相似的扭矩旋转，换句话说，γ亚基和c。这些亚基是酶中的旋转体，并且它们的旋转被认为对于催化和 H^+ 运输的耦合很重要。