GH_4C_1細胞で見られたオートファジ-の解析とユビキチンの生理機能について

GH_4C_1细胞自噬及泛素生理功能分析

• 批准号: 06770017
• 负责人: 和栗 聡
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Iwate Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06770017/
• 关键词: GH_4C_1細胞; オートファジ-; ユビキチン; 局在; 免疫電顕法

(1)免疫組織化学によるオートファゴゾームの生成機序の解析オートファジ-を誘導したGH4C1細胞を、凍結超薄切片上での免疫電顕法にて解析した。カテプシンB、H、L、および1gp120に対する抗体でリソゾームを標識したところ、リソゾーム自身が細胞質、分泌顆粒、残余小体、などを取り込む像が多数見られた。このことは、この細胞に見られるオートファゴソームが、飢餓時の肝臓に見られるようなマクロオートファジ-(小胞体による包み込み)ではなく、ミクロオートファジ-(リソゾームによる食べ込み)により生成されることを示唆する。(2)ユビキチンの局在共焦点レーザー顕微鏡を用いた蛍光抗体法と免疫電顕法を用いてこの細胞におけるユビキチンの局在を検索したところ、核、細胞質、リソゾーム、および空胞にユビキチンの免疫反応が認められた。特に空胞内では電子密度の高い顆粒の表面に、強いユビキチンの免疫反応が認められたこと、またミクロオートファジ-によって取り込まれるオルガネラの膜表面や残余小体内の膜成分上にも認められたことより、ユビキチンがミクロオートファジ-、あるいはオートファゴゾームの成熟過程に何らかの役割を持つことが示唆される。一方、パーコールを用いた密度勾配遠心により細胞分画を得、ウエスタンブロットによりユビキチンを解析したところ、リソゾームおよび細胞質分画に遊離型のユビキチンが認められた。また、僅かであるが膜分画(まだ特定していない)には、タンパクに結合したユビキチンと思われる高分子量のバンドも見られた。現在、細胞分画中のオルガネラを免疫電顕で解析する手法を確立している過程である。

（1）通过免疫组织化学的机理分析了通过免疫组织化学的机理，通过在冷冻巴掌中诱导自动FAJ-FAJ的GH4C1细胞分析了免疫电子方法。当指示组织蛋白酶B，H，L和1GP120的抗体时，有许多图像在其中岩石本身掺入了细胞，分泌颗粒和剩余的小物体。这意味着在这些细胞中看到的自动Fassom是由Microat Faji（溶酶体进食）而不是宏观的Faji（包裹在审美体中），如饥饿时所见。 （2）使用局部焦点激光显微镜和免疫电子方法，核，细胞质，液体和泛素免疫反应，使用局部焦点激光显微镜和免疫电子方法，使用荧光抗体方法在该细胞中搜索局部泛素时。特别是，在高密度颗粒的表面上识别出高密度颗粒的表面，并且在微型富士的薄膜表面上也识别出它的表面泛素在微观富士或自动助人的成熟过程中起作用。另一方面，使用PerCore通过密度梯度离心获得细胞分裂，并通过蛋白质印迹分析了泛素，并在溶酶体和细胞分离中识别出游离的泛素泛素。此外，有些膜分裂（尚未确定），还有很高的分子量带似乎是泛素与蛋白质的结合。这是建立一种通过免疫电子分析细胞分裂下有机细胞的方法的过程。

项目成果

Hiroshi Tomomasa: "Lysosomal cysteine proteinases in rat epididymis." The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 42. 417-425 (1994)

Hiroshi Tomomasa：“大鼠附睾中的溶酶体半胱氨酸蛋白酶。”

Yasuo Uchiyama: "Cell and tissue distribution of lysosomal cysteine proteinases,cathepsins B,H,and L,and their biological roles." Acta Histochemica et Cytochemica. 27. 351-372 (1994)

Yasuo Uchiyama：“溶酶体半胱氨酸蛋白酶、组织蛋白酶 B、H 和 L 的细胞和组织分布及其生物学作用。”